周期性張應(yīng)變對椎間盤纖維環(huán)細胞蛋白多糖表達的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的探討.pdf

1、研究背景 下腰痛是一個重要的公共衛(wèi)生問題，給家庭和社會帶來沉重的負擔。雖然引起下腰痛的原因很多，但是椎間盤退變?nèi)允侵饕蛩?。目前臨床應(yīng)用的治療方法主要解決臨床癥狀，而非針對退變早期的病理過程，并未延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。關(guān)于椎間盤退變的原因，雖然做出了許多有益的探討，但其確切發(fā)病機制仍然不清楚。只有在全面了解椎間盤退變機理之后，才可能進一步研究阻止其退變甚或使其再生的方法。 目前的觀點認為，椎間盤退變是一個由生物化學(xué)和生物

2、力學(xué)因素相互作用的復(fù)雜病理過程。椎間盤始終處于負荷狀態(tài)，尤其是椎間盤纖維環(huán)細胞總是受到不同形式的拉伸應(yīng)力作用。纖維環(huán)蛋白多糖含量的下降和/或成分的改變，可以引起纖維環(huán)的退變，進而導(dǎo)致整個椎間盤退變的發(fā)生。Aggrecan是椎間盤中蛋白多糖的主要成分。小鼠的Aggrecan基因突變后，可以發(fā)生椎間盤的退變。同時椎間盤蛋白多糖的更新速率較快，對外界刺激更為敏感。在本實驗中采用周期性張應(yīng)變模擬作用于纖維環(huán)的張應(yīng)力情況，觀察其對椎間盤纖維環(huán)細胞

3、蛋白多糖表達的影響。 力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號是一個非常復(fù)雜的過程，涉及到很多細胞內(nèi)、外成分。在很多類型的細胞中，力學(xué)刺激可以使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高和ERK1/2發(fā)生磷酸化，因此，鈣離子和EPK1/2信號通路被認為是細胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路。至于纖維環(huán)細胞是如何將機械應(yīng)力這一力學(xué)信號轉(zhuǎn)化成為細胞的生物化學(xué)信號，目前對其過程了解甚少。本實驗對纖維環(huán)細胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程進行探討，旨在揭示機械應(yīng)力在纖維環(huán)退變中的作用，從生物力學(xué)

4、角度探討椎間盤退變的發(fā)生機理。 實驗方法 1.大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞的培養(yǎng)和鑒定 采用酶消化法分離大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞，進行單層培養(yǎng)，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，通過甲苯胺藍、免疫細胞化學(xué)和堿性磷酸酶染色、透射電鏡觀察等方法對其表型進行鑒定。 2.種植于硅橡膠膜上的大鼠纖維環(huán)細胞的表型特征研究 利用倒置相差顯微鏡及透射電鏡觀察種植于纖維連接素包被的硅橡膠膜和塑料培養(yǎng)板中的纖維環(huán)細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化；

5、利用甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖的表達；通過免疫細胞化學(xué)和RT-PCR法檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原及Aggrecan的表達；采用流式細胞術(shù)觀察細胞表面整合素β1的表達；對不同培養(yǎng)基質(zhì)上的纖維環(huán)細胞的細胞周期進行分析；同時檢測纖維環(huán)細胞在硅橡膠膜上的貼壁和黏附情況。 3.周期性張應(yīng)變對纖維環(huán)細胞蛋白多糖表達的影響 采用自制周期性張應(yīng)變加載裝置，對培養(yǎng)椎間盤纖維環(huán)細胞進行不同形式的周期性張應(yīng)變刺激，然后利用RT-PCR檢測椎間盤纖維環(huán)中主

6、要蛋白多糖AggrecanmRNA的表達變化情況。 4.細胞內(nèi)鈣離子信號通路參與周期性張應(yīng)變影響纖維環(huán)細胞蛋白多糖表達的過程 1)采用激光掃描共聚焦顯微鏡和Fluo-3/AM熒光探針標記技術(shù)，測定周期性張應(yīng)變對纖維環(huán)細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，并分析了EGTA、維拉帕米和GdCl3處理對此影響的干預(yù)作用。 2)分別采用EGTA、氯化釓和維拉帕米阻斷細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，然后觀察周期性張應(yīng)變對纖維環(huán)細胞表達Aggr

7、ecanmRNA的影響情況。 5.MAPK信號通路在周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細胞蛋白多糖表達中的作用1)采用Westernblot分析周期性張應(yīng)變處理不同時間對椎間盤纖維環(huán)細胞MAPK家族中ERK1/2、JNK、p38信號分子磷酸化水平的影響，并分析相應(yīng)的阻斷劑及siRNA-ERK2對其磷酸化水平的抑制程度。 2)采用ERK1/2抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125預(yù)處理以及RNA干擾技術(shù)特異性阻斷ERK2后

8、，檢測周期性張應(yīng)變對纖維環(huán)細胞AggrecanmRNA表達的影響。 主要結(jié)果 1.大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞的培養(yǎng)和鑒定 細胞形態(tài)為圓形或多角形，胞質(zhì)內(nèi)含有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；原代細胞生長較慢，第一代細胞生長加快；細胞具有甲苯胺藍異染性；有Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的陽性表達；細胞堿性磷酸酶染色陽性。 2.種植于硅橡膠膜上的大鼠纖維環(huán)細胞的表型特征穩(wěn)定 種植于纖維連接素包被的硅橡膠膜和塑料培養(yǎng)板的纖維環(huán)細胞形態(tài)學(xué)

9、觀察無明顯差別；在兩種基質(zhì)上的纖維環(huán)細胞甲苯胺藍染色無差異；Ⅰ、Ⅱ型膠原、Aggrecan及整合素β1的表達亦無明顯差異；硅橡膠膜培養(yǎng)對纖維環(huán)細胞的細胞周期無明顯影響；纖維環(huán)細胞可以黏附于硅橡膠膜上生長。 3.周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細胞蛋白多糖的表達 2％和6％周期性張應(yīng)變對纖維環(huán)細胞AggrecanmRNA的表達無明顯影響；10％周期性張應(yīng)變使AggrecanmRNA的表達降低，2h降低20％左右，6h降低將近40％；

10、頻率在0.1-2.0Hz的應(yīng)變對AggrecanmRNA的表達無顯著影響。 4.細胞內(nèi)鈣離子信號通路參與周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細胞蛋白多糖表達的過程 1)應(yīng)變?yōu)?0％、頻率為1Hz的周期性張應(yīng)變1min使細胞內(nèi)Ca2+濃度增加1.13倍；EGTA可以完全阻斷此作用；而維拉帕米和GdCl3僅可部分阻斷。 2)EGTA、氯化釓和維拉帕米均可部分逆轉(zhuǎn)周期性張應(yīng)變對纖維環(huán)細胞AggrecanmRNA表達的影響，EGTA作

11、用最強，氯化釓次之，維拉帕米作用較弱。 5.MAPK信號通路參與周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細胞蛋白多糖表達的過程 1)周期性張應(yīng)變處理可引起纖維環(huán)細胞ERK1/2、JNK蛋白磷酸化水平上調(diào)，具有雙向、快速的特點；采用阻斷劑預(yù)處理，使其磷酸化水平降低。周期性張應(yīng)變對纖維環(huán)細胞p38磷酸化水平無明顯影響。 2)ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125以及RNAi特異性阻斷ERK2均可部分逆轉(zhuǎn)周期性張應(yīng)變下

12、調(diào)AggrecanmRNA表達的作用。 全文結(jié)論 1.成功培養(yǎng)了大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞，表型鑒定符合椎間盤纖維環(huán)細胞特征，為下一步實驗提供了前提條件。 2.種植于纖維連接素包被的硅橡膠膜上的纖維環(huán)細胞表型特征無改變，為進一步研究力學(xué)刺激對纖維環(huán)細胞的影響提供實驗基礎(chǔ)。 3.10％周期性張應(yīng)變可以使纖維環(huán)細胞AggrecanmRNA的表達降低；周期性張應(yīng)變從轉(zhuǎn)錄水平上影響纖維環(huán)細胞蛋白多糖的產(chǎn)生。 4

13、.周期性張應(yīng)變使纖維環(huán)細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，細胞外鈣內(nèi)流起主要作用，且有不同的鈣離子通道參與；阻斷細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，可以部分抑制周期性張應(yīng)變下調(diào)細胞AggrecanmRNA表達的作用。提示細胞內(nèi)鈣離子信號通路可能參與周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細胞蛋白多糖表達的過程。 5.周期性張應(yīng)變可以激活椎間盤纖維環(huán)細胞MAPK信號途徑；抑制MAPK信號通路的活化，可以部分逆轉(zhuǎn)周期性張應(yīng)變下調(diào)纖維環(huán)細胞AggrecanmRNA表達的作用