同種異體大鼠骨髓干細胞移植對急性肝衰竭大鼠治療的實驗研究.pdf

1、目的：1.探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離純化及鑒定方法。 2.研究不同途徑骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療急性肝衰竭的可行性。 方法： 1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng)：取雄性SD大鼠骨髓細胞懸液，用Percoll(1.073g/L)分離液分離(2000r，25min)得到單個核細胞，以每只大鼠一個培養(yǎng)瓶，接種于容積75ml的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO<,2>飽和濕度條件下培養(yǎng)。第5天更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細胞，以

2、后每3天換液一次。細胞長到80％融合時胰酶消化傳代，以1：3比例傳代擴增培養(yǎng)。對所得的細胞進行爬片后CD<,34>、CD<,44>免疫組化染色。 2.提取并標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞：用Percoll(1.073g/L)分離得到骨髓單個核細胞，貼壁法對問充質(zhì)干細胞進行純化，培養(yǎng)3周，傳代3次；DAPI標記細胞。 3.建立2-AAF肝損傷大鼠模型并移植骨髓間充質(zhì)干細胞：雌性清潔級封閉群SD大鼠60只，2-AAF以20mg/k

3、g/day，連續(xù)灌胃7天，后將2-AAF改為10mg/kg/day繼續(xù)灌胃，于第10天進行骨髓間充質(zhì)干細胞移植手術。將其隨機分為10組，每組6只。分別為移植前組、移植后1周組、移植后2周組、移植組分為經(jīng)門靜脈和經(jīng)腹股溝靜脈組，各移植組設陰性對照組。向移植組大鼠的門靜脈和腹股溝靜脈各移植10<'7>個骨髓間充質(zhì)干細胞，陰性對照組則注射等體積的生理鹽水。 4.肝功能檢測及TNF-a的檢測：細胞移植前及移植后1周及2周時，分別取實驗各

4、組6只實驗鼠心臟采血檢測血清白蛋白、谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶；并用ELISA法分別檢測各個組的TNF-a的值。 5．熒光顯微鏡觀察：移植后1周及2周處死實驗鼠，分別取肝組織，制成5μm冰凍切片，熒光顯微鏡觀察DAPI染色陽性細胞是否在肝臟組織中存在。 6．組織病理觀察：取細胞移植前及移植后1周和2周的肝組織，10％甲醛固定，石蠟切片，HE染色，觀察組織病理改變。 結果： 1．間充質(zhì)干細胞在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)7

5、2小時，去除未貼壁細胞，此時貼壁生長的骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量稀少，散在存在，多呈細而小梭形，隨著骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，10天左右細胞生長達80％-90％融合，其形態(tài)呈較均一的長梭形。將這些細胞再傳代3次，細胞擴增近100倍，細胞形態(tài)未見明顯改變。免疫組化法染色，CD<,34>陰性，CD<,44>陽性，證明得到的細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞而非造血干細胞。 2．2-AAF處理10天時，大鼠體重明顯減輕，瞼結膜、鼻腔粘膜及唇周有出血，牙齒

6、松動、變黑，精神萎靡，食欲減退。檢測血清肝功能示谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶均明顯升高，TNF-a升高。 3．2-AAF肝損傷大鼠，骨髓間充質(zhì)干細胞移植后1周，移植組大鼠谷丙轉氨酶與谷草轉氨酶及血清TNG-a均有降低，血清白蛋白升高；骨髓間充質(zhì)干細胞移植2周后，細胞移植組血清白蛋白明顯高于陰性對照組(P<0.05)，經(jīng)門靜脈和腹股溝靜脈注射兩種移植方式結果相似。 4．實驗鼠肝臟切片后在熒光顯微鏡下可以看到被DAPI熒光染色的細

7、胞5．肝組織病理檢查提示2-AAF可導致肝組織彌漫性損傷，鏡下可見細胞點狀壞死，腫脹呈氣球樣變。細胞移植后隨著時間延長，肝組織病變逐漸改善。 結論： 1．密度離心法和細胞貼壁法能分離出較純的MSCs，MSCs可用免疫組化法鑒定。 2．大劑量2-AAF可造成大鼠肝組織彌漫性損傷，同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞移植對2-AAF所致肝損傷有一定的治療作用。經(jīng)門靜脈和腹股溝靜脈移植干細胞的治療作用相當。 3．體外傳代培