環(huán)糊精偶聯(lián)低分子量聚乙烯亞胺構建新型非病毒轉基因載體及其應用.pdf

1、基因治療是將人正常的或有治療作用的基因通過一定方式導入靶細胞來干預疾病的發(fā)生、發(fā)展和進程,包括替代或糾正人自身基因結構或功能上的缺陷或錯誤,殺滅病變的細胞或增強機體清除病變細胞的能力等,從而達到治療的目的.現(xiàn)在基因治療已經(jīng)進行了較多的研究,并且有一些研究已經(jīng)進入臨床試驗階段. 在目前腫瘤的基因治療中,阻礙基因成功轉移的一個主要原因是缺乏較強靶向腫瘤細胞或組織能力的轉基因載體體系.為了提高轉基因載體的靶向性,選擇能與腫瘤特異性靶點

2、特異結合的靶向物來修飾轉基因載體顯得非常重要.在人類20-30﹪乳腺癌和部分卵巢癌的細胞中,Her-2受體過度表達,目前有一些研究利用針對Her-2受體的曲妥珠單抗與非病毒載體偶聯(lián),以提高非病毒轉基因載體靶向Her-2受體陽性腫瘤細胞的能力.但是抗體是較大的蛋白質(zhì),不宜重復給藥.所以本研究考慮使用可以與Her-2受體特異結合的靶向性的寡肽與新型非病毒載體偶聯(lián),本研究根據(jù)文獻報道,在噬菌體展示技術篩選得到的寡肽中選擇了一條能與Her-2受

3、體特異結合的高親和力寡肽(其氨基酸序列是Met-Ala-Arg-Ala-Lys-Glu),與新型載體連接,以提高載體與Her-2受體陽性腫瘤細胞或組織的特異結合能力.通過在一些Her-2受體陽性的乳腺腫瘤和卵巢腫瘤細胞中進行轉基因試驗,最終研制出一種新型的具有靶向性,低毒,可降解的高效率轉基因載體. 本研究分兩部分進行: 第一部分,選擇了水溶性好低毒性的多羥基化合物羥丙基環(huán)糊精(HP α-CD,2-羥丙基α-環(huán)糊精;HP

4、 β-CD,2-羥丙基β-環(huán)糊精;HPγ-CD,2-羥丙基γ-環(huán)糊精)作為骨架,同時選擇了低毒性的多氨基化合物,即低分子量多聚乙烯亞胺(分枝狀PEI 600 Da.和線型的PEI 423 Da)作為支鏈,通過一種可以形成可降解酯鍵的試劑羰二咪唑(CDI)進行連接形成新的共聚物,篩選出高效,低毒,可降解的新型載體. 第二部分,通過一段靶向寡肽與新型載體的偶聯(lián)(該寡肽可以與Her-2受體胞外段特異結合),從而使得新型載體具有一定靶

5、向能力,提高特異性.經(jīng)過體外體內(nèi)的試驗證實寡肽偶聯(lián)的新型載體具備了靶向到Her-2受體的腫瘤細胞的能力,提高了在靶細胞的轉基因效率,新型載體攜帶α-干擾素的真核表達質(zhì)粒在荷瘤裸鼠的基因治療中顯示了較好的治療效果. 第一部分 羥丙基環(huán)糊精偶聯(lián)低分子量聚乙烯亞胺構建新型非病毒轉基因載體 目的:選用羥丙基環(huán)糊精系列作為骨架偶聯(lián)低分子量PEI,以構建新型可降解,低毒,高效率轉基因載體. 方法:選擇了多羥基化合物羥丙基環(huán)糊

6、精作為骨架,同時選擇了多氨基化合物低分子量PEI(分枝狀PEI 600 Da和線型的PEI 423 Da)作為支鏈,通過試劑羰二咪唑進行連接形成多種新的共聚物,通過質(zhì)子核磁共振波譜法,紅外分光光度分析法,熱分析法等表征手段對新合成的共聚物的結構進行驗證,并通過質(zhì)子核磁共振波譜法檢測新共聚物的環(huán)糊精和PEI的相對組成.通過檢測粒徑大小,表面電荷以及通過DNA凝膠電泳阻滯試驗來評估新共聚物縮合DNA的能力.通過MTT法檢測共聚物對不同細胞毒

7、性.以合成的共聚物為載體攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)粒進行多種細胞轉染,觀察細胞的綠色熒光,使用共聚物攜帶熒光素酶質(zhì)粒進行多種細胞轉染,再用化學發(fā)光儀檢測熒光素酶與底物蛋白結合后顯示的相對熒光強度,評估轉染效率.并在有血清和無血清的培養(yǎng)液中,比較血清對載體的轉染效率的影響.在接近生理條件下進行共聚物的可降解性檢測. 結論:合成得到了HP α-CD-PEI 600,HP β-CD-PEI 600,HP γ-CD-PEI600,HP β-CD

8、-PEI 423,HP γ-CD-PEI 423等多種新的共聚物.HP β-CD-PEI600,HP γ-CD-PEI 600縮合DNA的能力較強.從中篩選出HP β-CD-PEI 600,HP γ-CD-PEI 600兩種較高轉染效率的新型載體.HPγ-CD-PEI 600達到最高轉基因效率的N/P比值較低,所以使用量小于HP α-CD-PEI 600和HPβ-CD-PEI 600.HP α-CD-PEI 600,HP β-CD-PE

9、I 600,HP γ-CD-PEI 600轉染細胞時,轉基因效率受血清影響較小,HP γ-CD-PEI 600轉基因效率受血清影響最小.因為HP γ-CD-PEI 600的轉基因效率高,用量小,在有血清培養(yǎng)液中的轉染效率下降最少,所以最終選擇了HP γ-CD-PEI 600進行第二部分試驗.比較共聚物的不同組成和轉基因效率的關系,認為PEI的接入量與共聚物縮合DNA的能力和轉基因的效率有直接的關系.新的共聚物中PEI的接入量高,共聚物縮

10、合DNA的能力強,轉基因的效率也較高. 第二部分 提高新型載體靶向Her-2受體陽性細胞的能力 目的:將新型載體HP γ-CD-PEI 600與靶向寡肽偶聯(lián),使其具有靶向到Her-2受體陽性的乳腺腫瘤或卵巢腫瘤細胞的能力. 方法:根據(jù)文獻報道的通過噬菌體展示技術篩選出來,針對Her-2受體蛋白的一段高親和力寡肽(序列為MARAKE)做為配體通過試劑SPDP偶聯(lián)新型載體HP γ-CD-PEI 600.質(zhì)子核磁共振波

11、譜法驗證寡肽與新型載體的偶聯(lián).偶聯(lián)寡肽的載體攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)粒及熒光素酶質(zhì)粒轉染Her-2受體陽性細胞(卵巢癌SKOV-3c細胞,乳腺癌SK-BR-3細胞和T 47D細胞)和Her-2受體陰性細胞(乳腺癌MCF-7細胞),用流式細胞儀檢測具有綠色熒光細胞百分率,化學發(fā)光儀檢測熒光素酶相對熒光強度,比較偶聯(lián)寡肽后與未偶聯(lián)寡肽載體的轉基因效率.通過自由寡肽的阻斷來比較偶聯(lián)寡肽的新型載體與未偶聯(lián)寡肽載體的轉染效率.體內(nèi)試驗使用SKOV-3c

12、細胞接種裸鼠成瘤,然后使用偶聯(lián)寡肽的新型載體攜帶α-干擾素的真核表達質(zhì)粒進行瘤內(nèi)注射,觀察腫瘤生長情況及裸鼠的生存期. 結論:新型載體易于偶聯(lián)新的功能性的基團,新構建的載體通過與靶向寡肽MARAKE偶聯(lián)后,可以提高對Her-2陽性腫瘤細胞基因效率.偶聯(lián)寡肽的載體具備了對Her-2陽性腫瘤細胞的靶向性.新型非病毒載體攜帶α-干擾素質(zhì)粒治療荷瘤裸鼠效果結果顯示了偶聯(lián)寡肽的新型載體具有較好的體內(nèi)應用前景.結論與展望:本研究選擇多羥

13、基的環(huán)糊精衍生物作為骨架,通過CDI這個試劑,與低分子量PEI進行偶聯(lián)形成新的共聚物.CDI是可以將具有羥基的化合物和具有氨基的化合物進行連接的試劑,并且連接在兩個化合物之間的酯鍵可以降解.在合成的共聚物中篩選到了有較強縮合DNA的能力的,轉基因效率較高的新型轉基因載體. 通過比較共聚物的不同組成和轉基因效率的關系,認為PEI的接入量與共聚物縮合DNA的能力和轉基因的效率有直接的關系.新的共聚物中PEI的接入量高,共聚物縮合DN