17605.草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白vp7核酸疫苗的研究

1、學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學位是本人在導師指導下進行的研究工作和取得的研究成果。本論文中除引文外，所有實驗、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實的。本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究所做的貢獻均已在論文中作了聲明并表示了謝意。學位論文作者簽名：玲哿襲日期：知m㈠7學位論文使用授權(quán)聲明研究生在校攻讀學位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬南京師范大學。學校有權(quán)保存本學位論文的電子和紙質(zhì)

2、文檔，可以借閱或上網(wǎng)公布本學位論文的部分或全部內(nèi)容，可以采用影印、復印等手段保存、匯編本學位論文。學?？梢韵驀矣嘘P(guān)機關(guān)或機構(gòu)送交論文的電子和紙質(zhì)文檔，允許論文被查閱和借閱。(保密論文在解密后遵守此規(guī)定)保密論文注釋：本學位論文屬于保密論文，保密期限為年。學位論文作者簽名：徐彳尋嶷日期：h伍、上、門艚教師虢傅紓。日期：M工r、[p摘要摘要草魚(CtenopharyngodonidelIus)是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種之一。長期以來，草魚出

3、血病(hemorrhagicdiseaseofgrasscarp)發(fā)病率較高，死亡率高達80％以上，草魚呼腸孤病毒(grasscarpreovirus，GCRV)已被證實為草魚出血病的病原。GCRV隸屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)，水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)，是中國分離鑒定的第一株魚類病毒，也是水生呼腸孤病毒屬中致病力最強的毒株。GCRV主要侵染于草魚肝臟、心臟、肌肉、腎臟、脾、鰓、腸道等活的組織細胞內(nèi)，導致化

4、學藥物難于達到治療效果，已成為草魚養(yǎng)殖發(fā)展中的“瓶頸”問題。GCRV不僅感染草魚，而且還感染青魚、麥穗魚以及某些海水魚等養(yǎng)殖魚類，對淡水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的危害。GCRV為立體對稱的20面體球形顆粒，由RNA核心和多層衣殼(內(nèi)殼層、中間層與外殼層)組成，其基因組為11條分節(jié)段的雙鏈RNA(doublestrandRNA，dsRNA)。近幾年，基因序列分析和三維結(jié)構(gòu)研究表明，成熟的GCRV顆粒由7種衣殼蛋白(VPl～vP7)組成，其中VP5

5、和VP7為病毒外衣殼組分，VP7蛋白是由GCRV第10片段編碼，己被揭示其在病毒感染及致病過程中起著不可替代的作用，并且具有較好的抗原性。VP5和VP7抗體都能與抗原中和，且VP7的抗體中和活性是VP5的3倍，表明VP7可能是GCRV主要的抗原決定簇，含有VP7基因的重組質(zhì)粒又可成功轉(zhuǎn)染到真核細胞中，使研制GCRV基因疫苗成為可能。核酸疫苗，又稱基因疫苗或DNA疫苗，是通過基因工程改造的DNA注入機體后產(chǎn)生免疫應(yīng)答來防治疾病一種新型疫苗

6、。具有抗原性強、保護時間長、安全性好、制備和運輸方便等優(yōu)點，大大克服了滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗等所存在的缺陷，已引起行業(yè)內(nèi)的廣泛關(guān)注。將團頭魴(Megalobramaamblycephala)的8肌動蛋白啟動子控制的VP7基因克隆進桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMDual中，同時將另一拷貝的VP7基因置于桿狀病毒多角體蛋白(polh)基因啟動子控制之下，構(gòu)建VP7基因核酸疫苗表達載體pFastBac—B—VP7lVP72。初

7、步開展了核酸疫苗的免疫效果以及對草魚出血病的免疫保護實驗。實驗設(shè)三個重組基因疫苗pFastBac一13VP7l—VP72劑量組，注射劑量分別為10峙、30“g、60嶺，空載體組注射pFastBacTMDual30pg，對照組不注射任何疫苗。免疫后第14、21、28、49、70天對草魚進行尾靜脈取血，通過RT—PCR檢測核酸疫苗的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄情況，問接凝集反應(yīng)測定抗體水平，第21天攻毒試驗來檢測各組的免疫保護效果。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pFast