SRBSDV和RRSV在介體飛虱體內(nèi)的侵染機理.pdf

1、近年來由南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）引起的南方水稻黑條矮縮病在我國南方稻區(qū)暴發(fā)流行，已成為我國目前水稻（Oryza sativa）生產(chǎn)上的重要病害之一。同時由水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus, RRSV）引起的水稻齒葉矮縮病也在我國南方稻區(qū)蔓延發(fā)生。SRBSDV是一種新發(fā)現(xiàn)的水稻病毒，屬于呼腸孤病毒科（Reovir

2、idae）斐濟病毒屬（Fijivirus）的一個暫定種，由新的介體白背飛虱（Sogatella furcifera）以持久增殖型方式傳播。RRSV是一種再次發(fā)生的老病毒，是呼腸孤病毒科（Reoviridae）水稻病毒屬（Oryzavirus）的代表種，由介體褐飛虱（Nilaparvata lugens）以持久增殖型方式傳播。目前，國內(nèi)的科研工作者已對這兩種水稻病毒的介體傳毒特性做了大量的研究，然而關于病毒在介體飛虱體內(nèi)的侵染機理知之甚少

3、，有關病毒在介體體內(nèi)的侵染循回過程以及復制和擴散機理還未曾報道。
　　本研究首先通過免疫熒光標記技術系統(tǒng)研究了 SRBSDV在其介體昆蟲體內(nèi)的侵染循回過程。明確了 SRBSDV在白背飛虱取食過程中首先進入中腸腸腔；隨后少量的病毒粒體侵入中腸上皮細胞并進行復制；增殖后的病毒從中腸上皮細胞向中腸表面的肌肉組織擴散；病毒在中腸表面沿著環(huán)肌和縱肌向鄰近的器官擴散；飼毒后6 d，部分白背飛虱體內(nèi)SRBSDV已通過血淋巴擴散到唾液腺；飼毒后8

4、 d，病毒在白背飛虱唾液腺中大量增殖，達到了系統(tǒng)性侵染，從而完成了整個侵染循回過程。SRBSDV與白背飛虱和灰飛虱的親和性具有明顯的差別，這可能與病毒在兩種介體體內(nèi)的侵染循回過程不同有關。通過共聚焦顯微鏡觀察SRBSDV在飼毒后25 d的灰飛虱消化系統(tǒng)的分布，發(fā)現(xiàn)灰飛虱的中腸內(nèi)可以檢測到病毒，但在唾液腺中檢測不到病毒，明確了 SRBSDV受到中腸釋放屏障的阻礙無法擴散到唾液腺，從而不能被灰飛虱有效傳播。
　　SRBSDV在介體昆蟲

5、內(nèi)的侵染會誘導形成提供病毒復制和裝配場所的球狀或纖維狀的電子致密內(nèi)含體——病毒原質（viroplasm）。為進一步研究 SRBSDV在介體昆蟲體內(nèi)的侵染和增殖機制，本研究在 SRBSDV侵染的白背飛虱培養(yǎng)細胞中觀察到病毒編碼的非結構蛋白 P9-1分布在病毒原質基質中。子代病毒粒體和病毒復制產(chǎn)生的病毒RNA積累在P9-1分布的病毒原質基質中。在體外體系中， SRBSDV P9-1可獨立形成類似于病毒原質基質的內(nèi)含體。這些結果表明， SRB

6、SDV P9-1是形成病毒原質基質的必需組分，形成的病毒原質是SRBSDV進行病毒RNA復制和病毒粒體裝配的場所。為了進一步驗證SRBSDV P9-1在病毒侵染介體過程中的功能，本研究首次將人工合成dsRNA誘導的RNAi技術與白背飛虱培養(yǎng)細胞技術相結合研究P9-1的功能。通過轉染針對P9-1基因的人工合成的dsRNA干擾P9-1基因在介體培養(yǎng)細胞中的表達顯著抑制病毒原質的形成和病毒在細胞中的侵染。將人工合成的P9-1基因dsRNA通過

7、膜飼喂法飼喂白背飛虱，抑制了 SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)的侵染和復制，從而阻礙了白背飛虱傳播病毒。因此，SRBSDV P9-1是病毒在介體昆蟲體內(nèi)有效侵染和復制所必需的。
　　SRBSDV侵染白背飛虱后必須從初侵染的中腸上皮細胞擴散到唾液腺才能被介體有效傳播，因此病毒在介體內(nèi)的擴散也是其完成侵染循回的關鍵環(huán)節(jié)。本研究在SRBSDV侵染的白背飛虱培養(yǎng)細胞中觀察到由非結構蛋白P7-1形成的包裹著病毒粒體的管狀結構可伸出侵染細胞的表面。

8、在體外實驗中，單獨表達的P7-1能在Sf9細胞中形成伸出細胞的小管結構，推測其參與病毒在介體昆蟲體內(nèi)的擴散。為了驗證 P7-1蛋白在病毒擴散過程中的作用，本研究通過病毒抗體中和培養(yǎng)細胞中游離病毒粒體后，仍可觀察到 P7-1管狀結構從初次侵染的細胞延伸到鄰近的健康細胞。體外轉染人工合成的針對 P7-1基因的 dsRNA有效抑制P7-1管狀結構的形成，阻礙 SRBSDV在細胞間的擴散，表明 P7-1管狀結構是SRBSDV在白背飛虱培養(yǎng)細胞間

9、安全擴散的重要通道。
　　P7-1管狀結構是否介導病毒在白背飛虱體內(nèi)擴散？通過免疫熒光標記分析發(fā)現(xiàn)P7-1管狀結構在白背飛虱體內(nèi)的擴散途徑與病毒的侵染循回過程一致，P7-1管狀結構從白背飛虱中腸上皮細胞首先擴散到中腸表面的環(huán)肌，并沿著環(huán)肌橫向擴散，當遇到與環(huán)肌交叉的縱肌后開始沿著縱肌縱向擴散，最后擴散到整個中腸和鄰近器官的表面。在 P7-1管狀結構到達的部位病毒才能進行復制，病毒的復制滯后于 P7-1管狀結構的擴散。通過酵母雙雜交

10、系統(tǒng)和免疫共沉淀技術發(fā)現(xiàn)P7-1與肌動蛋白（Actin）存在特異性互作。因此，P7-1管狀結構具備了在消化道外層肌纖維上運動的能力。通過膜飼喂法飼喂人工合成的針對 P7-1基因的dsRNA，有效抑制 P7-1管狀結構的形成，阻礙病毒在白背飛虱體內(nèi)的擴散，最終阻礙了白背飛虱傳播SRBSDV的能力，表明SRBSDV P7-1是病毒在白背飛虱體內(nèi)有效擴散所必需的。
　　本研究對 RRSV在其介體褐飛虱體內(nèi)的侵染循回過程和復制機理進行了分

11、析。首先通過免疫熒光標記技術明確了 RRSV在褐飛虱體內(nèi)的侵染循回途徑與SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)的侵染循回途徑大體相似。在病毒侵染褐飛虱過程中，由非結構蛋白Pns10誘導形成的病毒原質在中腸上皮細胞、中腸外層肌肉組織和唾液腺等組織均有分布。通過膜飼喂體外合成的針對Pns10基因的dsRNA抑制了病毒原質在介體昆蟲體內(nèi)的形成，阻礙病毒在褐飛虱體內(nèi)的侵染和復制，證明了Pns10蛋白是RRSV侵染介體褐飛虱所必需的。
　　綜上所述，本

12、研究首次闡明了SRBSDV和RRSV在不同飛虱體內(nèi)的侵染循回過程；首次將RNAi技術與介體昆蟲培養(yǎng)細胞相結合研究植物病毒編碼蛋白的功能，明確了SRBSDV非結構蛋白P9-1和RRSV非結構蛋白Pns10是形成病毒原質基質的組分，參與病毒在介體內(nèi)的復制，SRBSDV非結構蛋白P7-1蛋白是形成包裹病毒粒體的管狀結構的組分，參與病毒在介體內(nèi)的擴散。初步解析了SRBSDV和RRSV適應于相應介體昆蟲高效傳毒的分子機制，為利用RNAi原理培育轉