去甲腎上腺素對空腸彎曲菌的促生長作用鑒定及表達譜分析.pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)為彎曲菌屬中的一種食源性病原細菌，主要感染人引起腹瀉和腸炎，而且與人自身免疫性疾病格林-巴利綜合癥密切相關，該菌在宿主腸道內定居的詳細機制尚不清楚。人和動物腸道內的主要神經(jīng)遞質為去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)，研究顯示該激素可促進多種細菌的生長及毒力增強，增強細菌在腸道內定居的能力。因而鑒定去甲腎上腺素對空腸彎曲菌的促生長作用及表達譜分析將有助于理解空腸彎曲菌在腸

2、道定居及致病機理。
　　通過模擬宿主體內細菌的生存環(huán)境，本試驗鑒定和篩選了NE對空腸彎曲菌的促生長作用。首先選擇MEM、MH、DMEM等三種培養(yǎng)基進行篩選，分別篩選MEM培養(yǎng)基中胎牛血清（Fetal calf serum，F(xiàn)BS）濃度、NE濃度和細菌接種量，MH培養(yǎng)基中1，8-二氮-9-芴酮（1，8-diazafluoran-9-one，DFO）濃度、NE濃度和細菌接種量，DMEM培養(yǎng)基中細菌接種量，從而確定NE對細菌的最佳促生長

3、條件;然后鑒定NE合成通路中不同化學物質、腎上腺素拮抗劑以及轉鐵蛋白對NE促空腸彎曲菌生長效果的影響。研究結果顯示，在MEM培養(yǎng)基中最佳促生長條件為NE濃度100μmol/L、FBS濃度10％和細菌接種濃度100 CFU/mL，在此條件下NE促生長效果最顯著;在MH培養(yǎng)基中NE濃度與細菌接種濃度篩選結果與MEM培養(yǎng)基一致，而DFO添加濃度在不同批次MH培養(yǎng)基中出現(xiàn)變化，導致在MH培養(yǎng)基中NE對細菌的促生長效果不穩(wěn)定;在DMEM培養(yǎng)基中，

4、未獲得穩(wěn)定且重復性好的NE促生長條件。對于NE化學合成通路中的6種化學物質，具有3，4-二羥基苯環(huán)基團的3，4-二羥基-L-苯丙氨酸、多巴胺、腎上腺素和NE均具有顯著的促生長效果，而缺乏此基團的酪氨酸和苯丙氨酸則未檢測到明顯的促生長效果。在兩種腎上腺素受體拮抗劑普洛萘爾（β腎上腺素受體拮抗劑）和酚妥拉明（α腎上腺素受體拮抗劑）對NE促生長作用的鑒定中，酚妥拉明顯示具有一定的拮抗效果，但統(tǒng)計學差異不顯著，需要進一步試驗鑒定。單獨添加乏鐵轉

5、鐵蛋白（Apotransferrin）的培養(yǎng)基中細菌不生長，添加Apotransferrin和NE后細菌生長緩慢;添加富鐵轉鐵蛋白(Holotransferrin)后，無論是否添加NE，細菌均快速生長。本試驗結果對研究NE對空腸彎曲菌的促生長作用機制具有重要意義。
　　為了在基因轉錄水平上鑒定NE對空腸彎曲菌的促生長作用機制，本試驗利用基因轉錄譜芯片技術檢測在NE作用下空腸彎曲菌中轉錄發(fā)生變化的基因，并對這些基因進行功能聚類和蛋白

6、相互作用分析。針對空腸彎曲菌NCTC11168中的1654個基因設計探針利用基因表達譜芯片(Microarray)進行檢測，結果表明，通過設定P≤0.05和差異倍數(shù)(Fold change)≥1.5的檢測限，共檢測89個差異表達基因，其中包括56個表達上調基因和33個表達下調基因，這些基因涵蓋了多個生物學過程，包括細菌代謝、信息儲存與處理及細胞變化過程與信號轉導等，同時也參加了多條與鐵離子代謝有關的信號通路，包括ABC轉運信號通路、微生

7、物代謝有關的幾條信號通路。結果提示利用基因表達譜芯片可以篩選出NE作用下的差異表達基因，有助于鑒定NE對空腸彎曲菌的促生長作用機制。
　　為了在基因表達水平上鑒定NE對空腸彎曲菌的促生長作用機制，本試驗利用雙向凝膠電泳技術檢測NE作用下空腸彎曲菌中差異表達的蛋白，并利用質譜分析技術對差異蛋白進行鑒定。結果表明，雙向凝膠電泳共發(fā)現(xiàn)25個差異蛋白質點，其中21個差異蛋白質可以被質譜分析鑒定，包含17種蛋白質，其中多數(shù)蛋白為代謝酶或酶輔