LuxS-Al-2型密度感應系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌的調控研究.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC)引起的嚴重影響?zhàn)B禽業(yè)的傳染病之一。LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰性和陽性菌中，可產生用于細菌種間交流的通用自誘導信號分子AI-2(Autoinducer-2，AI-2)，在細菌的許多生理功能中扮演著重要的角色。目前禽致病性大腸桿菌復雜的血清型和廣譜的耐藥性，給禽大腸桿菌病的防控提出了新的挑戰(zhàn)，該菌LuxS/

2、AI-2型密度感應系統(tǒng)的研究國內外尚未見報道。
　　本研究旨在通過對APEC的LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)探究，為防控APEC感染，從細菌群體角度提供了新的思路，為進一步研究密度感應系統(tǒng)對APEC的調控功能和機理提供參考。
　　1.禽致病性大腸桿菌AI-2的檢測及其因素分析
　　為探討APEC中是否存在LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)。利用哈維弧菌BB170(vibrio harveyi BB170)對APEC是否

3、產生信號分子AI-2進行檢測，結果表明APEC能產生自誘導信號分子AI-2。
　　為探討禽致病性大腸桿菌在不同生長時期和不同培養(yǎng)條件下，信號分子AI-2活性與luxS和pfs的轉錄水平之間的關系。本研究利用哈維弧菌BB170檢測不同生長時期和不同培養(yǎng)條件下APEC的AI-2活性。同時利用Real-time PCR檢測APEC不同生長時期和不同培養(yǎng)條件下luxS和pfs的轉錄水平。結果表明，APEC在不同生長時期的AI-2活性與lu

4、xS的轉錄水平保持一致，而與pfs的轉錄水平則并不一致。對影響AI-2活性的因素研究表明，葡萄糖，麥芽糖和NaCl可增強AI-2活性和luxS轉錄水平，而蔗糖則下調AI-2活性和luxS轉錄水平。
　　2.禽致病性大腸桿菌AI-2的合成及其對生物被膜的影響
　　通過對APEC的luxS和pfs基因的克隆、表達和純化，成功獲得了可用于AI-2體外合成的可溶性重組蛋白LuxS和Pfs。
　　利用純化后的LuxS、Pfs與S

5、-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)同時體外催化作用后，成功獲得濃度為300μmol/L的信號分子AI-2。
　　為研究AI-2對APEC生物被膜形成能力的影響。本研究采用改良結晶紫半定量法和熒光染色法檢測AI-2對APEC生物被膜形成能力的影響。結果表明，AI-2在濃度為0.185mmol/L時，生物被膜形成能力顯著增強。
　　3.禽致病性大腸桿菌luxS缺失株的構建及致病性分析

6、>　　LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)對細菌具有重要的調控作用。為進一步研究該系統(tǒng)對APEC的調控作用，本研究構建了APEC的luxS的缺失株。AI-2活性檢測結果顯示，luxS的缺失株喪失產生信號分子AI-2的能力。櫻桃谷鴨半數(shù)致死量檢測結果顯示，luxS基因的敲除使APEC毒力下降31.5倍。對雞胚層纖維細胞DF-1細胞的黏附和入侵試驗結果顯示，luxS基因的敲除使APEC的黏附和入侵的能力，分別下降了50.0％和40.7％。相對于

7、野生株，luxS的缺失株在體內肝臟、脾臟和血液的載菌量分別下降了46.4倍、5.2倍和3.7倍。Real-time PCR結果顯示，與野生株相比，luxS的缺失株的部分毒力基因（iucD，fyuA，vat，ompA，iss，fimC和tsh）轉錄水平顯著下降(P＜0.05)。對細菌運動性研究結果表明，luxS的缺失導致了細菌的運動性降低。
　　通過以上研究證實了APEC存在LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)。APEC在不同生長時期的