海洋桔青霉W1抗真菌蛋白的分離純化與特性研究.pdf

1、植物致病真菌是造成主要糧食和經濟作物減產的頭號殺手，目前大量使用的化學農藥已經對環(huán)境和人類健康造成了巨大的負面影響。同時開發(fā)新型化學農藥的高成本及耐藥微生物的迅速出現等因素，引起我們對生物農藥的關注。其中，抗真菌蛋白因其來源廣泛及其獨特的作用機制，為新型抗真菌活性物質的研究提供了重要信息，并成為了研究熱點。此外，陸地生物資源已被大量開發(fā)，發(fā)現新型抗菌物質的可能性不斷下降，迫切需要尋找新的來源。海洋提供了非常特殊的生態(tài)環(huán)境，使海洋微生物能

2、夠進化出特殊的代謝途徑，產生更多新型的抗菌活性物質，將在植物病原菌治理及活性物質開發(fā)方面發(fā)揮重要作用，因此，從海洋微生物中分離抗真菌蛋白具有重要的研究意義。
　　為了從海洋中尋找具有高效抗菌活性的天然產物，本研究首先采用平板稀釋法和平板擴散法從深海中篩選活性菌株。通過使用不同配方的培養(yǎng)基，對采集自各種海洋環(huán)境（大洋、北極和南極）的深海樣品進行微生物菌株的分離篩選，篩選到了300余株真菌以及大量的細菌，其中包括了許多具有抗菌活性的微

3、生物。接著以7株植物病原真菌和7株致病細菌為指示菌進一步篩選并鑒定出具有高效抗菌活性的菌株，植物病原真菌包括宛氏擬青霉、膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌、綠色木霉、立枯絲核菌、長柄鏈格孢和核盤菌，致病細菌包括金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、溶壁微球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣假單胞菌和黃單胞菌。本研究共分離到57株具有抗植物病原菌活性的菌株，包括53株活性真菌和4株細菌，分別鑒定種屬并統計活性情況和樣品來源，為研究海洋抗菌微生物資源以及開發(fā)新型

4、抗菌活性物質奠定了良好的基礎。
　　更重要的是，本研究從西南印度洋底泥樣品中分離并鑒定出一株桔青霉，命名為W1。該菌株的發(fā)酵上清對多株植物病原菌具有拮抗活性，并通過采用鹽析、透析、凍干、陰離子交換色譜、陽離子交換色譜、超濾濃縮等方法，最終從海洋桔青霉W1發(fā)酵液上清中分離純化到一種抗真菌蛋白，將它命名為PcPAF。SDS-PAGE電泳結果表明，PcPAF的分子量大小約為10kDa。通過MALDI-TOF-TOF質譜鑒定以及N端測序分

5、析該蛋白的序列，根據分析結果判斷PcPAF可能為一種新的抗真菌蛋白，并檢測了該抗真菌蛋白的理化性質。結果表明PcPAF對4株植物病原菌真菌，綠色木霉、宛氏擬青霉、長柄鏈格孢和膠孢炭疽菌具有較強的抑制活性，紙片法檢測PcPAF對綠色木霉、尖孢鐮刀菌、宛氏擬青霉以及長柄鏈格孢的最低抑制濃度分別為1.52μg/disc、6.08μg/disc、3.04μg/disc和6.08μg/disc。PcPAF在80℃條件下處理20min其活性不受影響

6、;能夠耐受多種金屬離子處理，經過20mM的Mn2+處理后，能保持75％的抗菌活性;可以耐受酸性環(huán)境，并在弱酸環(huán)境中顯示出最好的抗菌活性;此外，PcPAF對紫外輻射，多種有機溶劑、表面活性劑以及蛋白酶都有較好的耐受能力，在一般條件下都能保持較好的抗菌活性。PcPAF與已經報道的真菌來源的抗真菌蛋白在序列和性質上都存在一定差異，可能是一種新的真菌來源的抗真菌蛋白。通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入甘氨酸能夠明顯挺高海洋桔青霉W1發(fā)酵上清的抗菌活性，抗菌