綿羊體外早期胚胎轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、應(yīng)用超數(shù)排卵和體外受精技術(shù)可大規(guī)模的生產(chǎn)胚胎，對促進(jìn)良種擴繁，縮短品種培育過程中世代間隔有重要意義。然而體外胚胎往往因為合子基因不能正常啟動，絕大多數(shù)的胚胎無法進(jìn)一步發(fā)育。為提高綿羊超數(shù)排卵的效率，揭示體外胚胎發(fā)育調(diào)控機理，本研究優(yōu)化綿羊成年羊、羔羊超排方案和體外受精相關(guān)技術(shù)參數(shù)，同時以綿羊體外早期胚胎為研究對象，利用高通量測序技術(shù)對其進(jìn)行miRNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄組分析。試驗共分五個部分。
　　試驗一:綿羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)研究<

2、br>　　本試驗通過優(yōu)化綿羊成年羊、羔羊超排方案和綿羊體外受精相關(guān)技術(shù)參數(shù)，為提高綿羊體外胚胎生產(chǎn)效率提供依據(jù)。在成年羊研究結(jié)果表明，應(yīng)用加拿大FSH(BionicheanimalhealthCanada)超排的平均黃體數(shù)顯著高于寧波FSH（12.47±1.54vs9.67±1.93，P＜0.05），應(yīng)用不同劑量(150mg和120mg)加拿大FSH超排結(jié)果差異不顯著(P＞0.05)，用30％PVP溶解FSH后超排結(jié)果顯著低于上述兩組(

3、P＜0.05)。羔羊誘導(dǎo)卵泡發(fā)育實驗結(jié)果表明，超排程序?qū)Τ判Ч绊戯@著，激素遞減法處理效果顯著優(yōu)于等量法，誘導(dǎo)發(fā)育卵泡數(shù)為（101.00±38.32vs.39.00±27.06，P＜0.05）。加拿大FSH超排后回收的可用卵子比例及體外受精后卵裂率均高于寧波FSH組。35-55日齡的羔羊作供體，誘導(dǎo)卵巢卵泡發(fā)育的效果較好。卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)26-30h效果較好，公羊個體間的差異直接影響著體外受精的效果，為此在體外受精前通過預(yù)備試驗選擇公

4、羊是很必要。本研究可為下一步綿羊體外胚胎樣品回收奠定基礎(chǔ)。
　　試驗二:綿羊體外早期胚胎的小RNASolexa高通量測序
　　miRNA與畜禽的主要生產(chǎn)性能和生長發(fā)育密切相關(guān)，主要參與細(xì)胞分化的調(diào)控，細(xì)胞增殖的調(diào)控，組織及器官生長發(fā)育的調(diào)控。本研究以綿羊體外不同發(fā)育時期的胚胎作為研究對象，回收20850枚體外受精胚胎，通過在構(gòu)建五個樣品小RNA文庫的基礎(chǔ)上，使用Solexa測序技術(shù)，綿羊卵母細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞

5、和桑葚胚分別獲得19，955，813、12，827，884、16，120，510、14，896，120和17，580，039條原始sRNA序列，卵母細(xì)胞與2-細(xì)胞公共uniquesRNA序列有44，332種，4-細(xì)胞與2-細(xì)胞公共uniquesRNA有180，329種，8-細(xì)胞與4-細(xì)胞公共uniquesRNA有292，820種，8-細(xì)胞與桑葚胚公共對應(yīng)uniquesRNA為31，626種。五個不同發(fā)育時期胚胎分別有398、429、46

6、7、485和242個miRNA家族參與表達(dá)，其中miR-10b在5個時期表達(dá)量均最高，表達(dá)量最低分別為miR-708-3p、miR-5398-3p、miR-960-3p、miR-99b-3p與miR-874;并預(yù)測出1797種novelmiRNA。以上數(shù)據(jù)極大拓寬了綿羊miRNA數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步篩選不同發(fā)育時期胚胎差異表達(dá)miRNA奠定基礎(chǔ)。
　　試驗三:綿羊體外早期胚胎差異表達(dá)miRNA篩選及功能注釋
　　miRNA表達(dá)具有

7、組織特異性和發(fā)育的時序性，在細(xì)胞生長發(fā)育的不同階段表達(dá)不同種類和數(shù)量的miRNA。本研究通過利用Solexa測序技術(shù)綿羊體外早期胚胎miRNA的鑒定，進(jìn)一步篩選出在綿羊卵母細(xì)胞與2-細(xì)胞期有900種miRNA表達(dá)差異，2-細(xì)胞與4-細(xì)胞期有613種miRNA表達(dá)差異，4-細(xì)胞與8-細(xì)胞期有521種miRNA表達(dá)差異，8-細(xì)胞與桑葚胚期有551種miRNA表達(dá)差異。選擇6個已知的miRNA進(jìn)行了QPCR驗證，表達(dá)趨勢與測序結(jié)果吻合。對上述

8、驗證的6個差異顯著miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測統(tǒng)計，數(shù)目分別為mir-28-3p，2430個;mir-202，3540個;mir-150，1577個;let-7b-5p，3045個;mir-21-5p，2411個;mir-143，4181個。預(yù)測的靶基因在結(jié)合功能和催化活性功能注釋基因數(shù)量較多，并在13個信號通路顯著富集，包括Wnt信號通路、自我吞噬調(diào)節(jié)和軸突導(dǎo)向等。本實驗可為研究探討miRNA調(diào)控綿羊體外胚胎發(fā)育的機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

9、>　　試驗四:綿羊體外早期胚胎轉(zhuǎn)錄組分析
　　為了全面獲得綿羊附植前胚胎表達(dá)譜發(fā)生的變化，本研究通過構(gòu)建綿羊體外早期胚胎轉(zhuǎn)錄組文庫，經(jīng)Illumina/Hiseq2000測序平臺，全面獲得綿羊附植前胚胎轉(zhuǎn)錄組信息。結(jié)果顯示，綿羊卵母細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞和桑葚胚分別得到53，076，288、54，795，850、54，160，208、51，978，906和54，160，208條Cleanreads，與參考基因組分別比對

10、到的reads所占比例為78.63％、71.45％、73.68％、74.62％和74.06％;五個時期分別獲得15，271、14，867、15，025、15，594和16，260個轉(zhuǎn)錄本，并且分別預(yù)測到7445、8090、8491、8963和8177個新轉(zhuǎn)錄本。綿羊體外不同發(fā)育時期胚胎主要發(fā)生了四種可變剪接ES、IR、A3SS和A5SS，發(fā)生SNP數(shù)量達(dá)到616，234個，優(yōu)化了37,544個基因，以上數(shù)據(jù)極大拓寬了綿羊轉(zhuǎn)錄組相關(guān)信息，

11、為進(jìn)一步篩選不同發(fā)育時期胚胎表達(dá)差異基因奠定基礎(chǔ)。
　　試驗五:綿羊體外早期胚胎差異表達(dá)基因篩選及注釋研究
　　應(yīng)用各種方法分離和分析差異表達(dá)基因是研究胚胎發(fā)育分化的關(guān)鍵，對闡明胚胎發(fā)育的內(nèi)在調(diào)控機制具有重要意義，而且還能為基因診斷與治療及新品種培育提供重要的理論依據(jù)。通過采用第二代高通量技術(shù)檢測綿羊體外不同發(fā)育時期胚胎表達(dá)譜，篩選出從卵母細(xì)胞到2-細(xì)胞期共有7950個差異表達(dá)基因;2-細(xì)胞發(fā)育到4-細(xì)胞共有1169個差異表

12、達(dá)基因;4-細(xì)胞發(fā)育到8-細(xì)胞共有3631個差異表達(dá)基因;8細(xì)胞發(fā)育到桑葚胚共有5851個差異表達(dá)基因。在聚類分析中，前兩組差異表達(dá)基因聚為一類，后兩組差異表達(dá)基因聚為一類。選擇5個基因進(jìn)行了QPCR驗證，表達(dá)趨勢與測序結(jié)果吻合。在GO功能聚類中，差異表達(dá)基因分別在細(xì)胞位置分別有46、11、31和41個terms顯著性富集，在分子功能上分別有25、8、10和15個terms顯著性富集，其中結(jié)合功能和蛋白結(jié)合功能兩個條目富集的基因數(shù)量最多