錦鯉皰疹病毒單交叉引物等溫擴增可視化檢測方法的建立.pdf

1、錦鯉皰疹病毒?。↘oi herpes virus disease，KHVD）是危害養(yǎng)殖鯉最為嚴重的病毒性疾病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須申報的疾病，我國將其列為二類動物疫病。KHV具有高度傳染性，毒力強，感染錦鯉、鯉及其普通變種。目前KHV的檢測方法大都需要昂貴的儀器設備，且操作復雜，需要專業(yè)技術人員操作，不能滿足現(xiàn)場快速診斷的要求。因此，目前亟需建立一種操作簡單、結果準確可靠、結果判定直觀、成本低廉的現(xiàn)場快速檢測方法，為疾

2、病的防控提供技術支撐。本論文對錦鯉皰疹病毒病的國內外流行現(xiàn)狀、檢測方法以及交叉引物技術的原理和應用等進行了闡述，研究與建立了一種與膠體金標記的核酸快速檢測試紙條相結合的錦鯉皰疹病毒單交叉引物等溫擴增的可視化檢測方法。
　　本論文研究的主要內容如下：
　　1.引物設計及病毒DNA重組質粒的構建。根據(jù)錦鯉皰疹病毒（Koi herpes virus，KHV）保守的DNA聚合酶（DNA polymerase，Sph）基因，設計了一組

3、單交叉擴增引物，包括交叉引物2a1s，探針引物2 a（2a-Bio）、3a（3a-FIT），剝離引物4s、5 a。利用錦鯉鰭條組織細胞系Koi-Fin培養(yǎng)增殖KHV，提取病毒基因組DNA。以4s、5a為引物和KHV基因組DNA為模板擴增KHV Sph基因的部分片段，然后將該基因片段克隆連接 pMD?-19T載體構建重組質粒pMD?-19T-Sph，作為后續(xù)實驗的標準DNA模板。
　　2.建立交叉引物等溫擴增（cross primi

4、ng amplification，CPA）的基礎反應體系及反應條件，并對其進行了優(yōu)化，最終建立了KHV單交叉引物等溫擴增（single cross priming amplification，SCPA）KHV-SCPA方法。本實驗依次優(yōu)化了引物濃度比例、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Betaine濃度、Bst DNA聚合酶用量以及反應溫度和擴增時間。最佳反應體系各成分終濃度為：1×ThermoPol? Reaction Buffer，交

5、叉引物2a1s1.0μmol/L，探針引物2a（2a-Bio）、3a（3a-FIT）各0.5μmo l/L，剝離引物4s、5a各0.6μmol/L，Mg2+濃度8.0 mmol/L，dNTPs濃度1.2 mmol/L，Betaine濃度0.7 mol/L，Bst DNA聚合酶用量5.6 U，模板DNA1μL，無核酸酶水補足至25μL。最佳反應溫度為63℃，最佳擴增時間為60 min，擴增產物經凝膠電泳呈現(xiàn)梯形條帶。
　　3.KHV

6、-SCPA特異性檢測及靈敏度測定。提取錦鯉皰疹病毒KHV、鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）、鰻鱺皰疹病毒（AngHV）、大鯢虹彩病毒（GSIV）、白斑綜合征病毒（WSSV）以及細菌病原嗜水氣單胞菌（Ah）基因組DN A，進行特異性檢測實驗，結果表明，KHV-SCPA檢測方法可特異性檢測出KHV。將常規(guī)PCR的檢測靈敏度與本研究建立的KHV-SCPA檢測靈敏度進行比較，結果表明，KHV-SCPA檢測方法靈敏度較之常規(guī)PCR法高出約1000倍

7、。與膠體金標記的核酸快速檢測試紙條相結合，在3~5min內可對等溫擴增反應產物進行可視化檢測。
　　綜上所述，本研究建立的KHV-SCPA檢測方法可在63℃下60 min內實現(xiàn)DNA擴增，特異性地檢測出KHV，靈敏度較之常規(guī)PCR方法高出約1000倍。結合核酸試紙條檢測技術，在3~5 min內可對反應產物進行可視化檢測。KHV-SCPA檢測方法不依賴昂貴的儀器設備與專業(yè)技術人員，可應用于錦鯉皰疹病毒的現(xiàn)場快速檢測中，為錦鯉皰疹病毒