海帶(Saccharina japonica)內參基因篩選及部分管家基因的系統(tǒng)進化分析.pdf

1、熒光定量PCR（qPCR）是進行基因表達量測定最準確易行的方法，近年來，它被越來越多的應用于探討功能基因表達量變化的研究中。運用熒光定量PCR研究基因表達時，需要內參基因對實驗過程進行校正，因此選擇合適的內參基因對于得出準確的實驗結果具有重要的意義。本研究中共選用了8個候選內參基因：Actin（肌動蛋白），EF1α（翻譯延伸因子1α亞基），UBA80（泛素融合蛋白80），GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶），UBA52（泛素融合蛋白52

2、），18S（核糖體18S亞基），TUA（微管蛋白α亞基），TUB（微管蛋白β亞基）。這些管家基因都是古老的基因，在生物界中廣泛分布。
　　在褐藻中除了水云基因組大規(guī)模測序注釋分析中所獲得的序列，還未見對這些管家基因克隆的報道。本研究對除18S外的另7個基因在海帶中首次成功進行了cDNA水平上的克隆，所獲得的7個基因序列長度分為：Actin，1131bp；EF1α，1323bp；α-Tubulin，1362bp；β-Tubulin，

3、1341bp；GAPDH，1002bp；UBA80，468bp；UBA52，387bp，相應的GC含量分別為62.8％，61.5%，65.4%，62.4%，59.4%，62.9%，59.9%，它們在各種藻類（紅藻、褐藻、綠藻、硅藻、隱藻、灰胞藻、定鞭藻）、高等植物、原生動物、原核生物和古菌中都有廣泛的分布。因此運用上述序列對部分內參基因（Actin，EF1α，GAPDH，TUA，TUB）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明這些基因的起源都不盡相同，

4、它的起源進化包含了復雜的生物學事件。
　　本研究在海帶不同組織部位及不同生長時期的表達穩(wěn)定性。通過熒光定量PCR得到各基因在各樣品中的Ct值，然后通過對原始Ct值的統(tǒng)計分析，以及利用三種內參篩選軟件（geNorm，NormFinder和Bestkeeper）對Ct值進行進一步分析發(fā)現，在海帶不同組織部位中，geNorm的分析結果顯示候選內參基因的穩(wěn)定性由高到低為：EF1α，UBA80，TUA，GAPDH，TUB，UBA52，18S

5、，Actin；NormFinder的分析結果顯示候選內參基因的穩(wěn)定性由高到低為：EF1α，UBA80，TUA，GAPDH，TUB，UBA52，18S，Act；Bestkeeper分析結果顯示UBA80和EF1α的穩(wěn)定性最好，而Actin在這三種軟件的分析中穩(wěn)定性均為最差。因此，在海帶不同組織部位中，EF1α和UBA80為最穩(wěn)定的內參基因組合。在海帶的不同生活時期中，geNorm的分析結果顯示候選內參基因的穩(wěn)定性由高到低為UBA80，EF

6、1α，Actin，TUA，TUB，UBA52，GAPDH，18S；NormFinder的分析結果顯示候選內參基因的穩(wěn)定性由高到低為UBA80，TUB，EF1α，UBA52，TUA，Actin，GAPDH，18S；Bestkeeper分析結果顯示UBA80和TUB的穩(wěn)定性較好，因此，在海帶不同生活時期中，UBA80和TUB為最穩(wěn)定的內參基因組合。而18S雖然自身表達量較為穩(wěn)定，但是與其它候選內參基因的匹配度很差，因此不適宜作為雙內參或多內