NSK三肽對(duì)日本腦炎病毒抑制活性的研究.pdf

1、日本腦炎（Janpaneseencephalitis，JE）又稱流行性日本腦炎（簡(jiǎn)稱乙腦）是由日本腦炎病毒引起的一種嚴(yán)重危害人畜健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。日本腦炎病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，與西尼羅病毒、登革熱病毒同屬。該病不但影響畜牧業(yè)尤其是養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，而且對(duì)人類的健康造成了極大的危害。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，具有廣譜的抗菌、抗病毒等多種生物活性作用的抗病毒肽逐漸成為開發(fā)這類藥物的極具潛力的藥品之一。
　　病毒在活細(xì)胞內(nèi)的增殖可

2、分為五個(gè)環(huán)節(jié)，即吸附、穿入、脫殼、生物合成、成熟組裝與釋放。阻斷病毒感染過(guò)程任一環(huán)節(jié)的藥物均可成為抗病毒藥物。E蛋白是乙腦病毒的囊膜蛋白和成熟病毒粒子表面的結(jié)構(gòu)蛋白，可與細(xì)胞膜受體相結(jié)合從而與細(xì)胞膜融合促使病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要蛋白，研究表明其與病毒的吸附和入胞有關(guān)?？共《倦牡淖饔脵C(jī)理一就是與細(xì)胞膜表面的一些受體結(jié)合從而達(dá)到抗病毒的作用。EDⅢloop3抗病毒肽就是通過(guò)阻斷病毒體表面位點(diǎn)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合達(dá)到抗病毒作用。
　　本研究

3、在EDⅢloop3抗病毒肽基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選得到抗日本腦炎病毒的三肽。研究的主要內(nèi)容如下:
　　一、實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)EDⅢloop3抗病毒肽第363-369位氨基酸通過(guò)點(diǎn)突變的方法進(jìn)行改造，測(cè)序正確，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta2大腸桿菌表達(dá)蛋白，親合層析和分子篩純化蛋白，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)，結(jié)果表明純化得到目的蛋白。
　　二、BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng)，JEV病毒的擴(kuò)增，TCID50測(cè)定病毒滴度。通過(guò)LDH法測(cè)定純化的蛋白對(duì)于

4、細(xì)胞的最大毒性濃度，蝕斑方法檢測(cè)突變后EDⅢloop3蛋白對(duì)日本腦炎病毒的抑制效果。結(jié)果表明N、S、K三個(gè)氨基酸在EDⅢ抗日本腦炎病毒中其重要作用。
　　三、利用不同濃度的NSK三肽作用BHK-21細(xì)胞后，進(jìn)行接種日本腦炎病毒，利用蝕斑試驗(yàn)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)，證明NSK三肽對(duì)日本腦炎病毒的抑制效果顯著，實(shí)驗(yàn)表明NSK三肽在濃度為100μM抑制效果極為顯著，并具有劑量依賴性和序列依賴性。
　　四、