抗草甘膦真菌的分離及EPSPS基因克隆與表達研究.pdf

1、草甘膦是一種高效、低毒、廣譜、內吸的非選擇性滅生除草劑。它于1974年在美國被注冊登記，是全世界除草劑消費量最大的品種之一。草甘膦能防除絕大多數一年生及多年生雜草，但由于其非選擇性，在殺死雜草的同時對農作物也具有毒害作用。而提高作物對草甘膦的抗性，有利于草甘膦在農業(yè)生產中的應用并降低生產成本。因此，抗除草劑基因的發(fā)掘與利用已成為當今生物基因工程領域研究的重點。
　　 從抗除草劑微生物中分離抗性基因是最主要的途徑。從受除草劑極端污

2、染的土壤中篩選抗除草劑菌株是一種有效的方法。本研究從生產草甘膦工廠排污口的污泥中篩選到一株高抗草甘膦的真菌，并對其進行了形態(tài)學鑒定、生理生化特性測定及18S rRNA分子鑒定。利用SMARTer技術構建了菌株的全長cDNA文庫。以抗草甘膦菌株假絲酵母菌TY-JM(Candidapalmioleophila)和黃曲霉TZ1985(Aspergillus flavus)為材料，首次從假絲酵母與黃曲霉中分離得到EPSPS基因，并將其轉化大腸桿

3、菌驗證其具有抗草甘膦功能，國內外未見報道。期望能為轉基因抗除草劑作物新品種的培育提供新的基因資源。
　　 主要研究結果如下：
　　 1.利用瓶培養(yǎng)富集技術，從生產草甘膦工廠排污口的污泥中篩選到一株抗草甘膦濃度高達900mmol/L的真菌，命名為TY-JM。結合形態(tài)學觀察、生理生化特性及18S rRNA序列分析，TY-JM被鑒定為假絲酵母菌Candida palmioleophila。形態(tài)學特征和生理生化特性與前人研究結果

4、一致，18S rRNA系統(tǒng)進化分析表明其與假絲酵母同源性高達99％，序列上傳至GenBank登錄號為JN656713。
　　 2.以菌株TY-JM總RNA為模板，利用Clontech公司CreatorTM SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit構建了TY-JM的cDNA文庫，并對文庫質量進行了鑒定。原始文庫滴度為2.58×106 cfu/ml，文庫庫容為2.58×106 cfu，擴增后滴度為3.

5、42×109 cfu/ml，重組率97.6‰文庫插入片段范圍為500 bp～3 kb，主要集中在1 kb附近，說明該文庫cDNA片段的序列比較完整，文庫質量符合標準。
　　 3.通過比較基因組學的方法，分離得到了假絲酵母TY-JM和黃曲霉TZ1985的EPSPS蛋白編碼序列。編碼序列長度分別為1311 bp和1353 bp，分別編碼436個氨基酸和450個氨基酸，理論分子量分別為46 kDa和48 kDa，等電點分別為5.77和

6、6.04。TY-EPSPS(TY-JM的EPSPS)和TZ-EPSPS(TZ1985的EPSPS)基因推導的氨基酸序列經NCBI Protein BLAST程序分析表明，TY-EPSPS基因與熱帶假絲酵母、杜氏假絲酵母和白假絲酵母等具有80%的序列一致性；與核盤菌、棒曲霉具有66%的序列一致性，TZ-EPSPS基因與煙曲霉、棒曲霉、黑曲霉、白曲霉和土曲霉具有90%的序列一致性；與杜氏假絲酵母、白假絲酵母和熱帶假絲酵母具有68%的序列一致

7、性。采用MEGA4.0軟件分析TY-EPSPS和TZ-EPSPS基因與其它種的EPSPS的進化關系，結果表明，TY-EPSPS和TZ-EPSPS均與真菌的EPSPS親緣關系較近，而與植物和細菌的EPSPS親緣關系較遠。其中TY-EPSPS與酵母屬親緣關系最近，TZ-EPSPS與曲霉屬的親緣關系最近。
　　 4.將TY-EPSPS和TZ-EPSPS連接pET-30a載體后轉入大腸桿菌BL21(DE3)后，使大腸桿菌對草甘膦的抗性從