DNA條形碼技術(shù)在主要實(shí)蠅類害蟲識別中的應(yīng)用.pdf

1、實(shí)蠅(Tephritidfruitfly)類昆蟲屬雙翅目Diptera、實(shí)蠅科Tephritidae,遍布全世界的熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū),種類多,寄主范圍廣,危害嚴(yán)重,為水果和蔬菜的重要經(jīng)濟(jì)作物害蟲。COI基因是線粒體呼吸鏈上編碼細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ的基因,相對于其它分子標(biāo)記其最大優(yōu)勢為,相對保守但又較容易被通用引物擴(kuò)增,同時又有足夠的變異能夠?qū)⑽锓N區(qū)別開來。DNA條形碼技術(shù),即通過對COI基因5’端一段長度約為650bp的基因片段進(jìn)行

2、測序和序列分析,進(jìn)而在DNA水平上成功地區(qū)分物種。本學(xué)位論文以口岸經(jīng)常截獲的實(shí)蠅類害蟲的幼體(卵、幼蟲、蛹)以及成蟲殘體(頭部、胸部、腹部、足、翅)為靶標(biāo),采用DNA條形碼技術(shù),從口岸快速檢疫檢驗(yàn)和準(zhǔn)確識別的角度,研究實(shí)蠅類害蟲幼體及成蟲殘體的快速分子檢測鑒定技術(shù)。并對口岸經(jīng)常截獲的離腹寡毛實(shí)蠅屬的21種實(shí)蠅進(jìn)行物種鑒定,探討其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,為離腹寡毛實(shí)蠅屬昆蟲進(jìn)化關(guān)系的研究提供分子依據(jù)。最后通過構(gòu)建實(shí)蠅類害蟲DNA條形碼識別數(shù)據(jù)庫,為

3、實(shí)蠅類害蟲的遠(yuǎn)程檢測和監(jiān)測,防止其在我國進(jìn)一步傳播擴(kuò)散提供技術(shù)支撐。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.DNA條形碼識別技術(shù)對實(shí)蠅類幼體及殘體的識別鑒定
　　 實(shí)蠅類害蟲多為國內(nèi)外檢疫對象,其鑒定識別方法主要依據(jù)成蟲的外部形態(tài)特征,而傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)識別法對口岸經(jīng)常截獲的幼體及殘缺的蟲體,則無能為力。本研究以桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis的幼體(卵、幼蟲、蛹)以及成蟲殘體(足、翅、頭部、胸部、腹部)為

4、對象,利用DNA條形碼技術(shù),構(gòu)建實(shí)蠅類害蟲快速鑒定技術(shù)體系,并以其他4種常見實(shí)蠅(包括番石榴實(shí)蠅B.correcta、瓜實(shí)蠅B.Cucurbitae、南亞果實(shí)蠅B.tau、柑桔大實(shí)蠅B.minax,)為對象對該技術(shù)體系進(jìn)行應(yīng)用驗(yàn)證。結(jié)果顯示,桔小實(shí)蠅幼體以及成蟲殘體的堿基序列與數(shù)據(jù)庫中靶標(biāo)種COI基因堿基序列的一致性為99.51%～99.84%,其他4種實(shí)蠅相應(yīng)序列與數(shù)據(jù)庫中靶標(biāo)種COI基因序列的一致性分別為100%,100%,99.8

5、1%～99.83%和100%;以鄰接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,靶標(biāo)種實(shí)蠅均與數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)種實(shí)蠅聚為一支,且置信度均為100%。以K2-P模型計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離得出,5種實(shí)蠅的種間遺傳距離為0.0597～0.2363,平均為0.1693;種內(nèi)遺傳距離為0.0000～0.0041,平均為0.0019。表明,基于DNA條形碼的物種識別技術(shù)完全可用于口岸截獲的實(shí)蠅類害蟲幼體及殘體的準(zhǔn)確鑒定。
　　 2.DNA條形碼技術(shù)在離腹寡毛實(shí)

6、蠅屬常見實(shí)蠅中的應(yīng)用及其系統(tǒng)發(fā)育分析
　　 本研究以離腹寡毛實(shí)蠅屬常見的8個亞屬21種具有重要經(jīng)濟(jì)意義的實(shí)蠅為對象,利用DNA條形碼技術(shù),通過對線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(mtDNACOI)基因(約650bp)片段的測序和比對,對其進(jìn)行物種的識別鑒定與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。NJ、MP、ML三種系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果基本一致,各物種都聚為一支,置信度為90%以上。以Kimura2-paramete雙參數(shù)模型計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離,得出

7、,21種實(shí)蠅的種內(nèi)遺傳距離為0.0003～0.0068,平均為0.0043;種間遺傳距離為0.0154～0.2395,平均為0.1540:種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的35.8倍,而且,種內(nèi)、種間遺傳距離沒有重疊區(qū)域。表明,基于COI基因的DNA條形碼技術(shù)可以用于離腹寡毛實(shí)蠅屬昆蟲的快速鑒定識別,該技術(shù)體系的建立對實(shí)蠅類害蟲的檢測監(jiān)測具有重要意義。
　　 3.構(gòu)建實(shí)蠅類害蟲DNA條形碼識別系統(tǒng)
　　 本文通過自主研發(fā)并結(jié)合

8、資料收集和整理經(jīng)濟(jì)性實(shí)蠅條形碼相關(guān)信息,應(yīng)用ASP.NET動態(tài)網(wǎng)頁技術(shù)和C#編程語言,開發(fā)建立了包括地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata、桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis、橄欖果實(shí)蠅B.oleae、柑桔大實(shí)蠅B.minax等在內(nèi)的實(shí)蠅類害蟲DNA條形碼識別系統(tǒng),該系統(tǒng)為外來入侵生物預(yù)防和控制研究中心(CMIAS)中國主要外來入侵昆蟲DNA條形碼識別系統(tǒng)(DIASChttp://www.chinaias.cn)的重要組

9、成部分。該系統(tǒng)包括標(biāo)本庫、DNA條形碼庫以及知識庫。標(biāo)本庫擁有3屬35種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的實(shí)蠅類害蟲,共計(jì)1932個樣本,其中如桔小實(shí)蠅(561頭)、具條實(shí)蠅(311頭)、蜜柑實(shí)蠅(128)居多。DNA條形碼數(shù)據(jù)庫,共計(jì)收錄了5屬185種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的實(shí)蠅類害蟲2405條DNA條形碼序列,其中3屬29種291條序列為本研究獲得,5屬181種1696條序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫,5屬100種417條序列來自BOLD數(shù)據(jù)庫;本研究中的序列不

10、僅來自不同的實(shí)蠅種類,尚包含同一種類不同地理種群的序列如桔小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、南亞果實(shí)蠅、柑桔大實(shí)蠅等。知識庫中包括物種的中文名、拉丁學(xué)名、同物異名、中文異名、英文俗名、分類地位、形態(tài)特征(包括形態(tài)特征描述及圖片信息)、國內(nèi)外分布,寄主植物種類及危害、原產(chǎn)地、傳入和擴(kuò)散途徑,可能擴(kuò)散區(qū)域、預(yù)防控制和管理措施等基礎(chǔ)信息,涉及3屬31常見并具有重要經(jīng)濟(jì)意義的實(shí)蠅種類,其中,本實(shí)驗(yàn)獲得的29種中除迪奧實(shí)蠅外均包含知識庫各種基礎(chǔ)信息。實(shí)蠅類害蟲DN