紫花苜蓿單脫氫抗壞血酸還原酶基因MsMDAR的克隆及初步分析.pdf

1、基于基因在不同物種中的同源性設計引物，從紫花苜蓿中克隆出一段cDNA序列，經在NCBI上進行同源性比對和初步分析，推測該序列編碼單脫氫抗壞血酸還原酶，標記為MsMDAR。該基因的編碼區(qū)全長1302bp，推測編碼434個氨基酸(Genebank登錄號：JN979555)。
　　 將MsMDAR的完整開放閱讀框(ORF)插入到原核表達載體pET-30a(+)中，構建融合表達載體pET-MDAR，然后轉化大腸桿菌BL21(DE3)中用

2、IPTG誘導表達，產物為帶有His標簽的融合蛋白。SDS-PAGE分析表明該蛋白能在大腸桿菌中可以高效特異表達，產物大小與軟件預測結果相一致。將MsMDAR的ORF插入到表達載體pA7-GFP中，構建融合表達載體MDAR-GFP。利用基因槍技術轉化洋蔥表皮細胞，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞中的熒光強度分布。結果表明，該蛋白定位于洋蔥表皮細胞的細胞核中。
　　 將MsMDAR的ORF插入到表達載體pBI121中，得到可以過量表達MsM

3、DAR的重組表達載體pBI-MDAR，采用凍融法將重組載體轉入農桿菌GV3101中，最后將鑒定結果為陽性的農桿菌介導轉入煙草體內，期望得到超表達MsMDAR的轉基因煙草。對再生植株進行PCR、RT-PCR檢測以及GUS染色，最終確定2棵再生煙草苗為轉基因苗。利用pHANNIBAL中間載體和pART27表達載體，構建MsMDAR基因的RNAi載體，采用農桿菌介導法轉化到苜蓿中，得到該基因表達受阻的苜蓿苗。對再生植株的PCR檢測結果顯示，約