菊花CmMYB1和CmMYB2轉錄因子基因的克隆及功能鑒定.pdf

1、植物通過轉錄因子在轉錄水平上調控目的基因的表達來調控其生長發(fā)育及生理代謝。MYB轉錄因子是最大的植物轉錄因子家族之一，參與植物次生代謝調控、激素和環(huán)境脅迫的應答，并對細胞分化和植物葉片等器官的形態(tài)建成起重要的調控作用。菊花原產(chǎn)我國，是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，具有很高的觀賞和應用價值，在花卉生產(chǎn)中占有十分重要的地位。但菊花新基因的發(fā)掘和分子育種方始起步，本研究以菊花為研究材料，從中分離克隆出新的MYB轉錄因子，以期為MYB轉錄

2、因子在植物次生代謝調控及其脅迫應答等方面的研究提供一定的理論基礎。主要研究結果如下:
　　 1.根據(jù)菊花EST文庫篩選出2個MYB基因同源片段，據(jù)此設計基因特異引物，以自主選育的盆栽多頭菊品種‘鐘山紫桂’葉片為材料，通過3'、5'RACE-PCR分別得到全長為1，237 bp和1，331 bp的菊花MYB基因cDNA序列CmMYB1(JF795917)和CmMYB2(JF795918);其中CmMYB1具有一個846 bp的OR

3、F，編碼281個氨基酸及95 bp的5'非編碼區(qū)和296bp包含了多聚A尾的3'非編碼區(qū);CmMYB2具有一個948 bp的ORF，編碼315個氨基酸及86 bp的5'非編碼區(qū)和297 bp包含了多聚A尾的3'非編碼區(qū)。氨基酸序列比對表明，這2個基因均具有兩個MYB結構域，為典型的R2R3-MYB轉錄因子基因，其中CmMYB1基因屬于第4亞群成員，而CmMYB2基因屬于第22亞群成員。以基因組DNA為模板對CmMYB1和CmMYB2進行

4、PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)序列分析表明，CmMYB1含有1個307 bp的內(nèi)含子，而CmMYB2不含內(nèi)含子。
　　 2.克隆了CmMYB1、CmMYB2基因的啟動子序列并發(fā)現(xiàn)了一些與ABA及脅迫相關的作用元件。
　　 3.構建2個酵母效應質粒pGBKT7-CmMYB1和pGBKT7-CmMYB2，轉入酵母菌株Y2H中，并分別在缺陷培養(yǎng)基SD/-Trp上篩選后轉入SD/-His-Ade上培養(yǎng)，結果表明，CmMYB1和CmMYB

5、2均無明顯的轉錄激活功能。
　　 4.熒光定量PCR結果表明，CmMYB1和CmMYB2基因在菊花的根、莖、葉和花的5個發(fā)育階段都有表達，且在莖中的表達量最高，CmMYB1在葉片和花的完全著色與初開期時表達量較高，在根中表達較低;CmMYB2基因在葉中表達量也較高，但在根和開花的各個時期表達量均較低。脅迫應答的檢測結果顯示，在高鹽、干旱(PEG)、低溫和ABA誘導條件下，CmMYB2的表達量在處理后1h均有所增加，而CmMYB1

6、的表達量除了在低溫脅迫下略有上升外，其他脅迫條件下均較低。
　　 5.構建綠色熒光蛋白融合表達載體，農(nóng)桿菌介導法轉化洋蔥表皮細胞進行瞬時表達，結果表明，CmMYB1、CmMYB2蛋白位于細胞核中。
　　 6.構建植物表達載體pCAMBIA1301-CmMYB1和pCAMBIA1301-CmMYB2，利用農(nóng)桿菌介導法轉化擬南芥(Col-0)，通過潮霉素抗性、GUS染色及RT-PCR篩選鑒定陽性苗。轉CmMYB1植株和野生型

7、植株在表型上沒有區(qū)別;qRT-PCR檢測結果顯示，CmMYB1降低木質素合成途徑以及由總苯丙氨酸途徑通往木質素合成途徑的關鍵酶基因AtCAD（cinnamyl alcohol dehydrogenase，肉桂醇脫氫酶）、AtCOMT（caffeic acido-methyl-transferase，咖啡酸-O-甲基轉移酶）、AtC4H（cinnamate4-hydroxylase，肉桂酸-4-羥基酶）和At4CL1（4-coumarat

8、e-CoA ligase，4-香豆酸:輔酶A連接酶）的表達，結果在CmMYB1表達的擬南芥中，木質素含量降低。轉CmMYB2植株較野生型開花延遲，葉片數(shù)目增多，耐脅迫檢測結果表明，CmMYB2在擬南芥中的過表達，增強了轉基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性;qRT-PCR檢測結果顯示，過表達CmMYB2擬南芥中RD22、RD29A、RAB18、COR47、ABA1扣ABA2等脅迫相關基因的表達量增強;此外，CO（CONSTANS）、FT（F