檸檬酸合成酶基因與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因轉(zhuǎn)化苜蓿的研究.pdf

1、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界栽培歷史最悠久、面積最大、利用最廣泛的一種豆科牧草，被譽(yù)為“牧草之王”。在我國(guó)北方有大面積種植，而南方酸性土壤中鋁毒的存在限制了苜蓿在該地區(qū)的推廣，因而培育對(duì)鋁耐受力強(qiáng)的苜蓿新品種是解決苜蓿在南方種植的重要措施。近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展及對(duì)植物耐鋁機(jī)制研究的不斷深入，為我們使用分子手段培育耐鋁苜蓿新品種奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究以渝苜一號(hào)紫花苜蓿的15號(hào)植株和以此植

2、株為材料轉(zhuǎn)化了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的P-83號(hào)植株為材料。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法，將檸檬酸合成酶(CS)基因分別轉(zhuǎn)入這兩種材料中，并對(duì)轉(zhuǎn)化了CS基因植株、PEPC基因植株、CS-PEPC雙基因植株進(jìn)行PCR及RT-PCR檢測(cè)，鑒定目的基因的整合與轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，然后進(jìn)行酶活測(cè)定，有機(jī)酸含量測(cè)定，有機(jī)酸分泌量測(cè)定及耐鋁試驗(yàn)。
　　 本研究目前取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化得到29個(gè)抗性植株，這

3、些植株經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)得到6株轉(zhuǎn)基因苗，其中C-P-2、C-P-6、C-P-11、C-P-19為轉(zhuǎn)化CS-PEPC雙基因植株，CS-4、CS-9為轉(zhuǎn)化CS單基因植株。將經(jīng)過(guò)PCR鑒定的6株轉(zhuǎn)基因植株用RT-PCR檢測(cè)顯示均能在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)，CS基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)最強(qiáng)的是轉(zhuǎn)雙基因植株C-P-11和C-P-2，而PEPC基因表達(dá)最強(qiáng)的是轉(zhuǎn)PEPC單基因植株P(guān)-83。
　　 2測(cè)定了不同轉(zhuǎn)基因植株葉片CS活性及PEPC活性，結(jié)果顯示：各類植

4、株CS酶活性水平從高到低依次是轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株、轉(zhuǎn)CS單基因植株和野生株，其中轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株C-P-2的CS活性最高，達(dá)0.0225μmol NADH/min/mg protein，約為野生株的2.6倍；各類植株P(guān)EPC活性水平從高到低依次是轉(zhuǎn)PEPC單基因植株、轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株和野生株，其中轉(zhuǎn)PEPC單基因植株P(guān)-83的PEPC活性最高，達(dá)0.049μmolNAD/min/mg protein，約是野生

5、株的2倍，其次為轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株C-P-2，PEPC活性達(dá)0.0442μmolNAD/min/mg protein。
　　 3測(cè)定了不同轉(zhuǎn)基因植株葉片和根尖有機(jī)酸含量，結(jié)果顯示：對(duì)于葉片草酸含量、蘋果酸含量和檸檬酸含量，與野生株相比，轉(zhuǎn)基因植株有顯著增加，而且轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株高于轉(zhuǎn)CS單基因植株，轉(zhuǎn)CS單基因植株高于轉(zhuǎn)PEPC單基因植株；對(duì)于根尖草酸含量，轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株和轉(zhuǎn)CS單基因植株根尖草酸含

6、量高于轉(zhuǎn)PEPC單基因植株和野生株，CS-PEPC雙基因植株、CS單基因植株和PEPC單基因植株三者對(duì)提高根尖蘋果酸和檸檬酸含量無(wú)顯著差異，但均顯著高于野生株。
　　 4測(cè)定了根系有機(jī)酸分泌量，結(jié)果顯示，當(dāng)無(wú)鋁處理時(shí)，各轉(zhuǎn)基因植株根系有機(jī)酸分泌量無(wú)顯著差異。當(dāng)植株受鋁脅迫時(shí)，各轉(zhuǎn)基因植株之間的草酸分泌量無(wú)顯著性差異，但均顯著高于野生株；蘋果酸分泌量從多到少的分別是轉(zhuǎn)PEPC單基因植株、轉(zhuǎn)CS單基因植株和轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株

7、；檸檬酸分泌量則是轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株比轉(zhuǎn)CS單基因植株多，轉(zhuǎn)PEPC單基因植株未被測(cè)出檸檬酸分泌。在受到鋁毒害時(shí)，野生株也沒(méi)有被測(cè)出蘋果酸和檸檬酸的分泌。
　　 5耐鋁性試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)無(wú)鋁處理時(shí)，各植株根伸長(zhǎng)正常，伸長(zhǎng)量無(wú)顯著性差異，根尖不能被鉻天青染色。當(dāng)植株受鋁脅迫時(shí)，各類植株根伸長(zhǎng)量從長(zhǎng)到短依次是轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株、轉(zhuǎn)PEPC單基因植株和轉(zhuǎn)CS單基因植株；根尖染色程度即根尖受害程度從大到小依次是轉(zhuǎn)CS單基

8、因植株、轉(zhuǎn)PEPC單基因植株和轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株，其中轉(zhuǎn)雙基因植株C-P-2在20μM鋁脅迫時(shí)根尖未見(jiàn)到受害。
　　 本試驗(yàn)的結(jié)論：PCR檢測(cè)證明CS基因和PEPC基因能整合到紫花苜?；蚪M中，RT-PCR鑒定表明CS基因和PEPC基因均能有效在轉(zhuǎn)基因苜蓿植株中表達(dá)，提高了相關(guān)酶的活性，增加了葉片和根尖的有機(jī)酸含量，增強(qiáng)根系有機(jī)酸的分泌量，從而提高了對(duì)鋁的耐受能力。各類植株耐鋁能力從強(qiáng)到弱依次是轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株