家蠶生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中若干基因的克隆和分析.pdf

1、昆蟲(chóng)的蛻皮和變態(tài)是由保幼激素和蛻皮激素進(jìn)行調(diào)控的。同時(shí)，蛻皮激素對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)，發(fā)育和繁殖等都具有重要作用。昆蟲(chóng)體內(nèi)蛻皮激素的生理平衡主要是依靠其生物合成和降解。在大多數(shù)昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)階段，前胸腺是蛻皮激素的主要來(lái)源，其主要成分是ecdysone。在多數(shù)的鱗翅目昆蟲(chóng)中，前胸腺的主要產(chǎn)物是3-dehydroecdysone(3DE)，伴隨著比率不斷變化的ecdysone。
　　 昆蟲(chóng)體內(nèi)蛻皮激素水平的降低主要是由于蛻皮激素的滅活和排泄造

2、成的。蛻皮激素的滅活主要有三種途徑：(1)26-hydroxylation后再進(jìn)一步氧化形成26-oic acid，(2)形成不同種類(lèi)的共軛化合物(如：磷酸鹽)，(3)鱗翅目昆蟲(chóng)中，在ecdysone oxidase的催化下形成3-dehydroecdysteroid，隨后再被還原成3-epiecdysteroid，最后在磷酸轉(zhuǎn)移酶催化下形成磷酸鹽共軛化合物。在最后一個(gè)途徑中，主要有3個(gè)酶參與了該反應(yīng)，分別是ecdysone oxida

3、se，3DE3α-reductase和3DE3β-reductase。
　　 Ecdysone oxidase是蛻皮激素滅活途徑中一個(gè)關(guān)鍵的酶。本研究中，我們克隆并鑒定了家蠶ecdysone oxidase(BmEO)基因。BmEO基因的cDNA包含一個(gè)1695 bp的ORF，編碼564個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為62 kDa，等電點(diǎn)為4.6，屬于Glucose-methanol-choline oxidoreductas

4、e superfamily。分別在N-terminal和C-terminal包含有一個(gè)Glucose-methanol-choline oxidoreductase的功能域。用RT-PCR和Quantitativereal-time PCR的方法比較了BmEO基因在家蠶各組織中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)該基因主要是在血液中表達(dá)。家蠶幼蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中BmEO的表達(dá)水平變化與幼蟲(chóng)體內(nèi)蛻皮激素的滴度變化相對(duì)應(yīng)。給家蠶幼蟲(chóng)添食蛻皮激素可以誘導(dǎo)其表達(dá)。對(duì)BmE

5、O的RNAi可以使其表達(dá)量下降，減少這個(gè)酶可能會(huì)引起蛻皮激素滴度的增加。表型觀(guān)察結(jié)果顯示可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組的幼蟲(chóng)和蛹的死亡，并且表型與注射蛻皮激素的對(duì)照相似。可見(jiàn)該基因在昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育中的重要作用。
　　 3DE3α-reductase是該途徑中另一個(gè)關(guān)鍵的酶。我們克隆并鑒定了家蠶3DE3α-reductase基因。3DE3α-reductase基因的cDNA包含一個(gè)783 bp的ORF，編碼260個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為2

6、8 kDa，等電點(diǎn)為7.8。該基因?qū)儆趕hort-chaindehydrogenases/reductases superfamily，并且有一個(gè)NAD(P)-binding domain，推測(cè)其功能需要NADPH的存在。用RT-PCR-和Quantitative real-time PCR的方法比較了3DE3α-reductase基因在家蠶各組織中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)該基因主要是在中腸和血液中表達(dá)。家蠶幼蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中3DE3α-reduct

7、ase的表達(dá)水平變化與幼蟲(chóng)體內(nèi)蛻皮激素的滴度變化相對(duì)應(yīng)，該結(jié)果與BmEO的變化相似。
　　 3DE3β-reduerase也是該途徑中一個(gè)關(guān)鍵的酶。我們克隆并鑒定了家蠶3DE3β-reductase基因。3DE3β-reductase基因的cDNA包含一個(gè)972 bp的ORF，編碼323個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為39kDa，等電點(diǎn)為5.5。該基因?qū)儆赼ldo-ketoreductase(AKR)superfamily，該

8、基因也有一個(gè)NAD(P)-binding domain，推測(cè)其功能也需要NADPH的存在。這點(diǎn)和3DE3α-reductase十分相似。用RT-PCR和Quantitative real-timePCR的方法比較了3DE3β-reductase基因在家蠶各組織中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)該基因主要是在生殖器和脂肪體中表達(dá)。家蠶幼蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中3DE3β-reductase的表達(dá)水平變化與幼蟲(chóng)體內(nèi)蛻皮激素的滴度變化是一個(gè)相反的情況，由于其反應(yīng)是一個(gè)逆反

9、應(yīng)，因此該結(jié)果與BmEO和3DE3α-reductase的變化相反。
　　 JH的生理平衡取決于其合成和降解代謝。JH酯酶(Juvenile hormone esterase，JHE)，JH環(huán)氧化物酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase，JHEH)和JH二醇激酶(Juvenilehormone diol kinase，JHDK)是昆蟲(chóng)中JH降解代謝的3個(gè)關(guān)鍵酶。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，在JHE高表達(dá)