轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)玉米田間試驗(yàn)與遺傳穩(wěn)定性分析.pdf

1、近20年來(lái)，人們采用基因工程手段成功培育了一批抗蟲(chóng)、抗病、耐除草劑和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物新種質(zhì)，取得了令人矚目的成就。而一個(gè)轉(zhuǎn)基因的植株獲得后，通常還要對(duì)其后代進(jìn)行一系列基因純合鑒定、遺傳穩(wěn)定性的研究、農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀的篩選、產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中的種性保持等工作，所有這些過(guò)程都需要對(duì)目的基因進(jìn)行跟蹤調(diào)查，需要對(duì)大量的轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行篩選、鑒定。因此在轉(zhuǎn)基因作物研究繼續(xù)深入的同時(shí)，科學(xué)家們?cè)絹?lái)越重視轉(zhuǎn)基因與常規(guī)育種技術(shù)的結(jié)合，并加強(qiáng)了對(duì)轉(zhuǎn)基因作物后代性狀

2、的大田遺傳表達(dá)與變異研究試驗(yàn)，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行作物種質(zhì)創(chuàng)新，改良現(xiàn)有作物品種，最終實(shí)現(xiàn)作物轉(zhuǎn)基因植株從實(shí)驗(yàn)室走向大田生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。而基因轉(zhuǎn)入宿主后的有效表達(dá)及其穩(wěn)定遺傳，則成為轉(zhuǎn)基因植物實(shí)用化中的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　 國(guó)內(nèi)關(guān)于玉米轉(zhuǎn)Bt基因及Bt玉米遺傳穩(wěn)定性有一些報(bào)道，但多數(shù)是在轉(zhuǎn)基因株系的早期世代，以轉(zhuǎn)化植株的性能和基因功能的分析以及對(duì)國(guó)外Bt玉米的利用效果評(píng)價(jià)為目的，以國(guó)內(nèi)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因轉(zhuǎn)化獲得的Bt玉米材料

3、為基礎(chǔ)的鑒定工作不多，尤其是在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)玉米高代自交系的遺傳穩(wěn)定性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究對(duì)采用花粉管通道法轉(zhuǎn)crylAh基因抗蟲(chóng)玉米高代自交系（及其后代）和采用基因槍法獲得的轉(zhuǎn)Bt crylAh和crylIe雙價(jià)基因抗蟲(chóng)玉米植株，通過(guò)田間及室內(nèi)玉米螟抗性鑒定，利用PCR、RT-PCR、Southern blot、Western blot、ELISA等各種分子檢測(cè)手段對(duì)外源基因的遺傳穩(wěn)定性和遺傳規(guī)律等進(jìn)行了研究分析，

4、獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.通過(guò)PCR檢測(cè)確認(rèn)了陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，用Southern雜交進(jìn)一步證實(shí)了Bt基因已整合到受體植物基因組，用RT-PCR驗(yàn)證了Bt基因在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，用Western雜交證實(shí)了Bt基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)。遺傳分析表明，Bt基因在遺傳傳遞過(guò)程中符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，是單位點(diǎn)顯性方式遺傳。外源基因crylAb，crylIe和2mG2-epsps三個(gè)外源基因在轉(zhuǎn)基因玉米基因組中完全連鎖，表現(xiàn)為共分離，就

5、像單個(gè)基因位點(diǎn)一樣一起傳遞到下一代而沒(méi)有分離。
　　 2.CrylAh在同一轉(zhuǎn)基因事件的不同植株間表達(dá)量有所不同，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著；在不同轉(zhuǎn)基因事件間的表達(dá)量存在顯著差異；同一植株同一發(fā)育時(shí)期不同器官CrylAh的表達(dá)量不同，苞葉和葉片外源基因蛋白表達(dá)量比較高，花粉最低，各組織部位外源基因蛋白表達(dá)量順序：苞葉>葉>莖>雄穗>雄穗柄>雌德尖>籽粒>花絲>花粉。Bt殺蟲(chóng)蛋白在玉米中的表達(dá)具有時(shí)空特異性，不同生育時(shí)期，CrylA

6、h在葉片和莖中的表達(dá)量不同，呈動(dòng)態(tài)下降趨勢(shì)。
　　 3.不同的轉(zhuǎn)基因事件與不同常規(guī)玉米自交系進(jìn)行雜交，雜交后代的外源基因表達(dá)量不同，這與親本外源基因表達(dá)量高低及另一親本的基因型有很大關(guān)系。要想得到高表達(dá)量的雜交后代，則需要選擇外源基因表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因自交系做親本；通過(guò)玉米螟抗性鑒定和外源基因表達(dá)量的測(cè)定，表明外源Bt基因通過(guò)雌配子的傳遞頻率高于通過(guò)雄配子的傳遞頻率，因此盡量選擇抗性親本止向方式進(jìn)行雜交，這樣獲得表達(dá)量高的雜交后代

7、的幾率會(huì)高一些。
　　 4.無(wú)論是轉(zhuǎn)crylAh單價(jià)基因抗蟲(chóng)玉米自交系及其雜交、回交后代，還是轉(zhuǎn)crylAh和crylIe雙價(jià)基因抗蟲(chóng)玉米經(jīng)連續(xù)四代的田間、室內(nèi)玉米螟抗性檢測(cè)，結(jié)果對(duì)亞洲玉米螟均表現(xiàn)出很好的抗性，并且這種抗性可以逐代穩(wěn)定遺傳，說(shuō)明外源Bt基因的導(dǎo)入對(duì)防治亞洲玉米螟的危害是有效的。通過(guò)ELISA對(duì)CrylAh蛋白表達(dá)量的檢測(cè)，其變化規(guī)律與蟲(chóng)測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明田間、室內(nèi)鑒定與分子鑒定相結(jié)合能更準(zhǔn)確地說(shuō)明Bt殺蟲(chóng)蛋白

8、對(duì)亞洲玉米螟的抗性強(qiáng)弱，進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明抗蟲(chóng)玉米CrylAh蛋白表達(dá)量與雄穗柄倒折率和室內(nèi)生測(cè)7天幼蟲(chóng)死亡率具有顯著的相關(guān)性，與食葉級(jí)別、百株隧道長(zhǎng)度具有極顯著的相關(guān)性。說(shuō)明玉米中Bt蛋白含量的高低是轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)玉米螟產(chǎn)生抗性強(qiáng)弱的內(nèi)因。
　　 5.轉(zhuǎn)crylAh和crylIe單、雙價(jià)基因抗蟲(chóng)玉米及其后代與受體對(duì)照比較，在穗行粒數(shù)及禿尖長(zhǎng)上有一定的差異，差異顯著，禿尖變短和穗行粒數(shù)增加表現(xiàn)為產(chǎn)量的提高，而在株高、穗位高、穗

9、長(zhǎng)、穗粗、穗行數(shù)及千粒重上差異不大，經(jīng)檢驗(yàn)差異不顯著。
　　 6.轉(zhuǎn)crylAh基因抗蟲(chóng)玉米與受體對(duì)照比較，除了在栽培地試驗(yàn)時(shí)產(chǎn)量比受體自交系高外，在栽培地、荒地條件下，其出苗率、長(zhǎng)勢(shì)、株型、生育期、株高等方面均無(wú)顯著差異；在荒地條件下，玉米出苗率均很低，撒播處理的出苗率還不到5％；雜草的覆蓋度高于玉米的覆蓋度，存在顯著或極顯著差異，說(shuō)明玉米的生存競(jìng)爭(zhēng)能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于雜草；種子發(fā)芽試驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)crylAh基因抗蟲(chóng)玉米后代種子發(fā)芽活