豬腦心肌炎病毒的分離鑒定及RT-LAMP快速檢測方法的建立.pdf

1、腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的多種脊椎動物以腦炎、心肌炎、心肌周圍炎及繁殖障礙為主要臨床特征的急性人畜共患傳染病。臨床上,腦心肌炎病毒感染最嚴重和最廣泛的動物是豬,可引起仔豬致死性心肌炎,造成急性死亡,死亡率最高可達100％；導致懷孕母豬流產、產死胎、弱胎、木乃伊胎。人感染后可呈現輕度腦炎癥狀。腦心肌炎不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失,同時也危害著人類的健康。
　　

2、 本研究對河北地區(qū)發(fā)病豬場疑似豬腦心肌炎病料進行大量采集并處理,接種到BHK-21細胞上進行病毒的分離培養(yǎng),通過RT-PCR技術,序列測定,病毒感染力的測定及理化特性實驗進行鑒定。實驗結果:分離得到的病毒能夠在BHK-21細胞上生長,細胞出現圓縮、崩解等病變； RT-PCR擴增結果得到286bp的目的片段,與預期的結果一致；序列測定分析結果與預期的結果相同,其核酸序列及氨基酸序列與GenBank公布的其他EMCV毒株的序列同源性為100

3、％；該株EMCV不耐酸,對氯仿和胰蛋白酶不敏感,不耐熱,該毒株在50℃,1h的條件下喪失活性。
　　 環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)通過具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶完成靶序列的擴增,僅需恒溫就能擴增DNA,并可通過核酸染料染色觀察結果。對RNA病毒不需要單獨進行反轉錄反應,可以直接在同一反應管中進行反轉錄和擴增(RT-LAMP)反應。本研究將R

4、T-LAMP技術用于EMCV的檢測中,根據GenBank公布的豬腦心肌炎病毒基因序列,對其進行序列比對篩選保守序列。最后針對GenBank X74312毒株的保守序列(6232bp-6441bp)篩選并驗證RT-LAMP特異性引物。引物合成后初步建立RT-LAMP反應,對反應結果用Hinf I限制性內切酶進行酶切鑒定,并對所建立的RT-LAMP反應體系及條件進行優(yōu)化；對RT-LAMP方法的靈敏度和特異性以及重復性與穩(wěn)定性進行了檢驗。同時

5、,分別用本試驗建立的RT-PCR和RT-LAMP方法對36份提取的RNA樣品進行檢測。實驗結果表明,RT-LAMP最佳反應溫度是63℃,反應時間為50min；最佳反應體系(25μL)為:內引物(FIP和BIP)各2.5μL,外引物(F3和B3)各0.5μL,3μL dNTPs(2.5mM),2.5μLMgCl2(25mM),2.5μL10×Bst DNA Buffer,1.5μL Bst DNA聚合酶,2μL RNA提取物和6μL DE