抗凝血酶Ⅲ轉(zhuǎn)基因山羊遺傳穩(wěn)定性的檢測.pdf

1、本試驗以ATⅢ轉(zhuǎn)基因原代山羊及雜交產(chǎn)生的后代組成的轉(zhuǎn)基因山羊核心群為研究對象，以ATⅢ基因(AntithrombinⅢ，ATⅢ)作為檢測的目的基因，利用PCR技術、定量PCR技術、ELISA技術對轉(zhuǎn)基因山羊核心群ATⅢ基因的轉(zhuǎn)基因構件的完整性、山羊外源基因整合位點的平均拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)入的外源基因RNA的表達量及山羊乳腺中蛋白的表達量進行了檢測，探討了影響基因表達的因素及山羊群體轉(zhuǎn)基因世代遺傳的穩(wěn)定性。結(jié)果如下:
　　 1、提取轉(zhuǎn)基因

2、山羊耳部組織DNA，依據(jù)ATⅢ基因在嶗山奶山羊β-酪蛋白基因上構造的轉(zhuǎn)基因構件設計引物進行PCR擴增，3個家系的20只山羊都擴增出了ATⅢ基因。轉(zhuǎn)基因構件擴增結(jié)果顯示:在A系轉(zhuǎn)基因山羊的4個不同世代的個體中，都擴出了1.4kb長的預期片段，經(jīng)測序分析，在同一家系四個世代轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳中，轉(zhuǎn)基因表達框完整，含有插入的酶切位點(Xho1)、Enterokinase蛋白質(zhì)酶切DNA序列目的基因序列，目的基因序列與GENEBANK公布的ATⅢ

3、基因序列保持一致，且四個世代間沒有出現(xiàn)構件的丟失，通過有性繁殖遺傳穩(wěn)定。
　　 2、設計外源基因ATⅢ及山羊管家基因GAPDH的引物，對20只山羊樣品進行PCR擴增檢驗，以ATⅢ、GAPDH基因陽性克隆子倍比稀釋的質(zhì)粒標準品進行實時熒光定量PCR，并繪制標準曲線，通過標準曲線計算外源基因的平均拷貝數(shù)。結(jié)果:ATⅢ和GAPDH基因標準曲線方程分別為LogN1=-0.411CT+11.902;LogN2=-0.343CT+10.58

4、8。通過目的基因ATⅢ和山羊內(nèi)源參照基因GAPDH起始模板數(shù)的比較計算獲得:陰性對照的平均拷貝數(shù)為0.052，確定陰性對照目的基因拷貝數(shù)為0，山羊A-23、A-24、A-39、A-46、A-43，可判定為非轉(zhuǎn)基因個體，其余計算得到的山羊個體間外源基因的拷貝數(shù)相差很大，有6只山羊拷貝數(shù)為10以下，6只山羊拷貝數(shù)為10-15，拷貝數(shù)20以上的有2只。
　　 3、提取轉(zhuǎn)基因山羊乳腺組織mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin作為內(nèi)

5、參基因進行熒光定量PCR，以半定量的方法檢測選取的5只轉(zhuǎn)基因山羊個體間目的基因ATⅢ的相對表達量。對3個家系中10只雌性山羊的奶樣進行收集，送由醫(yī)院通過ELISA法對ATⅢ基因在乳腺組織中的表達量進行檢測。結(jié)果表明:外源目的基因ATⅢ在乳腺組織中蛋白表達量同ATⅢ基因mRNA的表達量的變化相一致，乳腺組織中蛋白的表達量在同一家系中的不同個體間有較大差異，即使同系同代山羊個體間表達量也不盡相同，后代山羊外源蛋白的表達量與上一代相比有升高也