泥鰍生長(zhǎng)激素基因在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)是所有脊椎動(dòng)物包括魚(yú)類維持正常的生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的一種單鏈多肽激素，在機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。具有促進(jìn)脂類降解，加速蛋白合成等作用。天然魚(yú)體中GH含量低，許多研究證實(shí)，重組生長(zhǎng)激素具有天然生長(zhǎng)激素的功能，因此，為了得到大量具有生物活性的重組生長(zhǎng)激素，本論文成功將泥鰍生長(zhǎng)激素基因(Misgurnus Anguillicaudatus GH，MaGH)克隆入pPIC9K表達(dá)載體，并實(shí)

2、現(xiàn)在畢赤酵母(Pichiapastoris)的分泌表達(dá)。
　　 以成體泥鰍腦垂體中提取的總RNA為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增并克隆cDNA，根據(jù)MaGH兩端序列改造，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(上游引物加入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物加入NotⅠ酶切位點(diǎn))擴(kuò)增了泥鰍的GH成熟肽cDNA。將獲得的泥鰍生長(zhǎng)激素基因表達(dá)片段，經(jīng)酶切后連接到能夠獲得高拷貝數(shù)，并含有酵母相應(yīng)信號(hào)肽的pPIC9K表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得重組pPIC

3、9K-MaGH酵母高效表達(dá)載體。用質(zhì)粒PCR方法篩選陽(yáng)性克隆，用EcoRⅠ和NotⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒。測(cè)序表明MaGH正確插入α分泌信號(hào)開(kāi)放讀碼框的下游。再將獲得的pPIC9K-MaGH重組子線性化處理，經(jīng)氯化鋰轉(zhuǎn)化組氨酸缺陷型畢赤巴斯德酵母GS115，轉(zhuǎn)化后的酵母菌株經(jīng)MD培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性重組子，提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，用基因組PCR鑒定重組菌株。將這些克隆用誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY誘導(dǎo)，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，在上清中

4、檢測(cè)到MaGH，誘導(dǎo)4天時(shí)表達(dá)量最高，占上清總蛋白的53％，最高表達(dá)量為300mg/L。不同的pH值實(shí)驗(yàn)表明，最適pH值為6.0。將重組工程菌投喂泥鰍魚(yú)苗，實(shí)驗(yàn)魚(yú)的體重和體長(zhǎng)明顯高于對(duì)照組，達(dá)到顯著性差異，實(shí)驗(yàn)初步顯示分泌表達(dá)的MaGH具有促進(jìn)泥鰍生長(zhǎng)作用。
　　 本研究克隆到了泥鰍GH基因成熟肽的cDNA序列，并成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了泥鰍重組GH蛋白的高效表達(dá)，為進(jìn)一步開(kāi)展其應(yīng)用和生物活性檢測(cè)分析及研制新型魚(yú)類生長(zhǎng)飼料