朗德鵝C-EBP基因的克隆、表達(dá)及DNA甲基化分析.pdf

1、本文采用同源克隆的方法，獲得了朗德鵝C/EBPα和C/EBPβ基因的編碼區(qū)全序列，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，采用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件進(jìn)行了同源序列多重比對(duì)和分子系統(tǒng)發(fā)育分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time）PCR技術(shù)分析了鵝C/EBPβ基因的mRNA在不同組織的相對(duì)表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)了甜菜堿處理對(duì)朗德鵝肝臟C/EBPβ基因mRNA表達(dá)水平和啟動(dòng)子甲基化的影響。主要研究結(jié)果如下：
　　 1 C/EBPα和C/EB

2、Pβ基因的克隆測(cè)序：本實(shí)驗(yàn)根據(jù)其他物種的C/EBPα和C/EBPβ基因DNA序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出朗德鵝C/EBPα基因1401bp的序列(GenBank登錄號(hào)：EU502716)，C/EBPα基因2130bp的序列（GenBank登錄號(hào)：GU068582）
　　 2 C/EBPα和C/EBPβ蛋白的生物信息學(xué)分析：借助生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源和軟件，預(yù)測(cè)出鵝C/EBPα基因開放閱讀框的長(zhǎng)度為975bp，編碼324個(gè)氨基酸殘基，且兩側(cè)分別

3、是210bp的5’UTR和397bp的3’UTR。通過(guò)對(duì)蛋白序列相似性檢索，預(yù)測(cè)出鵝C/EBPα蛋白不合有信號(hào)肽，不含有跨膜區(qū)，定位于細(xì)胞核中，而且確定其含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。推測(cè)豬鵝C/EBPα蛋白具有DNA結(jié)合活性，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 預(yù)測(cè)出C/EBPβ基因開放閱讀框的長(zhǎng)度為984bp，編碼327個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)對(duì)蛋白序列相似性檢索，預(yù)測(cè)出鵝C/EBPβ蛋白不合有信號(hào)肽，不含有跨膜區(qū)，定位于細(xì)胞核中，而且確定其含有亮

4、氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。推測(cè)豬鵝C/EBPβ蛋白具有DNA結(jié)合活性，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 3 Real-time PCR分析C/EBPβ基因在組織中的相對(duì)表達(dá)：采用RT-PCR技術(shù)，分析了鵝C/EBPβ基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果表明：C/EBPβ基因在鵝的各個(gè)組織均表達(dá)，但在肝臟、脂肪組織和肺臟表達(dá)量明顯高于其它組織，因此推測(cè)C/EBPβ基因在鵝肝臟脂肪代謝過(guò)程具有重要作用。
　　 4 Real-time PCR分

5、析甜菜堿處理對(duì)朗德鵝肝臟C/EBPβ基因表達(dá)水平的影響：采用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了填飼過(guò)程中添加甜菜堿對(duì)朗德鵝肝臟中C/EBPβ基因mRNA的表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，填飼可以極顯著提高朗德鵝肝臟中C/EBPβ基因mRNA的表達(dá)水平(P＜0.01)，而填詞的過(guò)程中添加甜菜堿可降低朗德鵝肝臟中C/EBPβ基因mRNA的表達(dá)水平(P＜0.01)。
　　 5亞硫酸氫鈉測(cè)序法檢測(cè)不同處理對(duì)朗德鵝肝臟C/EBPβ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的