李紅葉性狀RAPD標記及CHS基因cDNA的克隆.pdf

1、查爾酮合酶(Chalcone Synthase，CHS)是類黃酮合成途徑中的一個關鍵酶。CHS表達量的增加或減少都可能導致植物葉色的變異。本研究利用RAPD技術，篩選出與李屬(Prunus)植物紅葉性狀相連鎖的分子標記；并采用同源克隆的方法，克隆5種李屬植物查爾酮合酶基因的cDNA序列。主要研究結果如下：
　　 1.以紅葉李(P.salicina×P.atropurupurea)和安哥諾李(Prunus salicina cv.

2、‘angenuo')為雜交組合，正反交后得到56株F1代雜交苗。結合分離群體分組分析法(Bulked Segregate Analysis，BSA)，依據F1代雜交苗葉片顏色劃分出“紅葉”和“綠葉”兩個分離群體，構建“紅葉”和“綠葉”兩個近等基因池。應用RAPD標記技術，用隨機引物對兩個基因池、父母本及其余F1代個體DNA進行PCR擴增，篩選與李屬植物葉片紅色性狀相連鎖的分子標記。研究結果顯示，通過對350個隨機引物的篩選，獲得一個在紅

3、葉基因池中能穩(wěn)定擴增而在綠葉基因池中不出現(xiàn)的RAPD標記，該擴增條帶大小約為2 300 bp，命名為S450-2 300。經過重復性驗證和F1代群體單株驗證，該標記片段僅在紅葉個體(重組型除去)中出現(xiàn)，表明與李屬植物葉片紅色性狀相連鎖，連鎖距離為11.2 cM。
　　 2.以紅葉李、安哥諾李、黑桿櫻李(Prunus wrasifers ‘Nigra')、美人梅(Prunus×bliriana ‘Meirenmei')和紫葉李(P

4、runus cerasifera var.atropurpurea)為試材，采集不同時期的葉片，用試劑盒法提取總RNA。以Oligo(dT)為引物，在反轉錄酶作用下合成cDNA第一鏈，并用設計的特異引物CHS-F和CHS-R進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，5種李屬植物各擴增出一條大約1 200 bp的條帶，與預期的條帶大小一致。用試劑盒將目的基因片段回收后與載體pGEM-T連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α。用上述特異引物對單

5、菌落進行PCR擴增，結果表明多數(shù)為陽性克隆菌落。將檢測為陽性克隆的菌落送測序公司測序，測序結果顯示，所得到的5種李屬植物的CHS基因cDNA序列長度為1 170 bp～1 176 bp，推測的氨基酸序列長度為389～391個氨基酸。CHS基因cDNA序列同源性分析表明，5種李屬植物的CHS基因之間同源性非常高，均在95％以上，其中美人梅與紫葉李之間更是高達99.3％。將序列在Genbank中Blastn，結果發(fā)現(xiàn)5種李屬植物與己報道的C