甘藍型油菜-野芥二體異附加系BAC文庫的構建及野芥BAC克隆的篩選.pdf

1、模式植物基因組學研究已進入后基因組學時代，即功能基因組學時代。在我國盡管水稻基因組全序列測序已經(jīng)完成，但總體上非模式植物的研究仍然處于由結構基因組學向功能基因組學過度階段，在一段時間內我國基因組學的研究仍將停留在起步階段，如BAC文庫的構建及基于BAC的物理作圖等方面的研究。油菜是世界上和我國最重要的油料作物之一，由于其基因組較大，致使其基因組學的研究滯后于擬南芥等模式植物的研究。本研究利用甘藍型油菜.野芥二體異附加系(中國農(nóng)科院油料所

2、胡瓊老師已申請專利)為材料，構建其BAC文庫，為開展油菜基因組學的研究奠定一定的技術平臺。 構建大片段DNA文庫的關鍵技術包括載體和大片段DNA的制備兩個方面。大量轉化后，得到了69120個克隆，這些克隆以單菌落的方式保存于180塊384孔板中，組成單克隆文庫。本文庫插入片段平均為110 kb，以甘藍型油菜單倍體基因組120.Mb計算，該文庫共覆蓋了6.336倍以上的基因組，篩選到任一基因的可能性大99.82％，另外分別用葉綠體

3、基因psbA及線粒體基因atp6為探針，通過菌落雜交檢測，沒有細胞器DNA的污染。 基于Southern技術的菌落原位雜交是分子生物學的經(jīng)典實驗方法。以打碎的野芥(新疆野生油菜18號)基因組作為探針，分別在無外源基因組做封阻和500倍中雙四號基因組做封阻的條件下，對野芥和中雙四號BAC克隆進行雜交，結果顯示，在無外源基因組做封阻時，野芥克隆均有陽性信號，這些信號中的一部分在500倍中雙四號基因組封阻時消失，說明兩種基因組間有一定

4、的同源序列；此外，野芥和中雙四號部分克隆都出現(xiàn)的強烈陽性信號，并且這些信號的強度基本不受封阻影響。因此，用野芥基因組作探針時，雖能獲得陽性信號，但這些信號是非特異的，無法為后期篩選野芥BAC克隆提供可靠的依據(jù)。 核酸的復性動力學研究表明，在真核生物的基因組中存在著大量不同拷貝數(shù)的重復序列，其中有些是一個種或一個基因組所特有的。以野芥的種特異性重復序列為探針，對二體異附加系BAC文庫進行篩選，就可以得到野芥來源的克隆，為下一步獲得