聚肌胞體內外抗病毒活性、毒性研究及其微囊的制備與評價.pdf

1、聚肌胞（polyinosinic:polycytidylic acid copolymer,Poly I:C）是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物,是一種高效的干擾素(IFN)誘生劑,具有廣譜抗病毒、刺激吞噬、調整機體免疫、抗腫瘤、抗某些細菌和原蟲感染等功能。目前Poly I:C的應用報道多集中在人類醫(yī)學上用于治療肝炎、皰疹病毒感染及一些腫瘤性疾病等方面,顯示了其確實的臨床療效。雖然Poly I:C在獸醫(yī)臨床中也有治療豬瘟、鴨瘟等疾病的報道,但

2、與此相關的資料卻十分鮮見,更缺乏深入的研究。本文對Poly I:C體內外抗病毒活性及毒性作用進行了研究,并為解決Poly I:C價格昂貴,在體內容易被血清酶降解及注射使用易造成應激反應等限制其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中使用的問題,制備了具有緩慢釋放作用的Poly I:C微囊并對其進行了體內外效果評價。
　　 Poly I:C對離體培養(yǎng)雞胚CEF細胞的抗病毒活性研究為探討Poly I:C的抗病毒效果及其機理,選擇雞新城疫病毒（Lasota株）

3、和水皰口炎病毒(vsv)對離體培養(yǎng)的雞胚成纖維(CEF)細胞進行病毒感染,分別研究Poly I:C對離體培養(yǎng)雞胚CEF細胞的病毒抑制和干擾素測定試驗。試驗結果表明,Poly I:C能顯著抑制NDV在CEF細胞上生長,但Poly I:C對NDV的抑制作用并非隨著其劑量的增加和作用時間的延長而增強,60μg/mL的PolyI:C在CEF細胞上作用12h后,產生的抗病毒活性最強；PolyI:C抑制水皰口炎病毒在CEF細胞上生長的結果表明,Po

4、ly I:C具有免疫刺激活性,Poly I:C能誘導IFN-a mRNA和IFNβmRNA轉錄水平升高,說明Poly I:C的抗病毒作用和其誘導產生的干擾素有關；而且IFN-βmRNA轉錄水平是IFN-a mRNA表達量的數(shù)倍,說明IFlN-β在抗病毒活性中起主要作用；然而,Poly I:C也同時能抑制CEF細胞的生長,且與Poly I:C劑量和作用時間成正比,說明Poly I:C具有一定的毒副作用,在臨床使用時,應注意使用劑量和使用頻

5、度.
　　 Poly l:C對感染NDV的雞胚和肉雞的抗病毒活性研究為探討Poly I:C在體內的抗病毒效果,本研究通過Poly I:C對感染NDV的SPF雞胚和肉雞進行了體內病毒抑制試驗.SPF雞胚體內病毒抑制試驗結果顯示,5 mg-mL-1的Poly I:C溶液（0.1 mL/枚）能明顯抑制NDV在SPF雞胚中的繁殖,減輕NDV對雞胚生長的抑制作用,降低病毒血凝價和雞胚死亡數(shù)；Poly I:C對內雞抵抗NDV感染的試驗結果顯

6、示,注射0.02 mg/kg.bw,0.01 mg/kg.bw和0.005 mg/kg'bw的Poly I:C后,肉雞死亡率分別為40％、20％和26.7％,均極顯著低于攻毒對照組的63.3％(P<0.01).
　　 Poly I:C誘導雞胚CEF細胞凋亡的研究為研究Poly I:C對CEF細胞的毒性及其機理,將Poly I:C與CEF細胞共孵育后,對CEF細胞活性、形態(tài)變化、磷脂酰絲氨酸外翻、DNA片段形成、caspase-3

7、,caspase-8,easpase-9活性變化及RIPKl mRNA和TNFRSF8 mRNA轉錄水平等進行檢測。試驗結果顯示,隨著Poly I:C藥物濃度和作用時間的延長,CEF細胞活性降低,成劑量和時間正相關,表明Poly I:C對CEF細胞具有一定的毒性作用；磷脂酰絲氨酸外翻和DNA片段形成顯示,Poly I:C可誘導CEF細胞的凋亡；隨著作用時間的延長,easpase-3活性升高,說明Poly I:C引起的凋亡和caspaps

8、e激活途徑相關；caspase-8活性升高,而easpase-9活性沒有顯著變化的結果說明Poly I:C誘導凋亡和死亡受體途徑相關；TNFRSF8 mRNA轉錄水平增加說明凋亡和TNFRSF8上調有關。
　　 Poly l:C微囊的制備與體外評價以乙基纖維(EC)為囊材,采用液中干燥法制備Poly I:C緩釋微囊。通過正交實驗對成囊試驗條件進行優(yōu)化,試驗結果表明,700 rpm轉速、0.4g硬脂酸鎂、2％司盤-80、囊材占丙酮

9、質量2.5％、丙酮和石蠟體積比30：30為最佳制備條件。對最佳條件制備的微囊進行體外試驗評價,微囊大小均一,平均粒徑93.56μm,載藥率為0.64％,包封率為74％,體外釋放度隨著聚乙二醇-2000(PEG-2000)的含量增加而增大。
　　 Poly I:C微囊對NDV感染肉雞IFN-α及免疫活性的誘導效應為了評價口服型Poly1:C微囊抗病毒的效果及其與注射型Poly I:C的療效差異,本文通過給新城疫病毒(NDV)感染肉

10、雞口服Poly I:C微囊,測定了人工感染NDV肉雞體內α-干擾素(IFN-α)和反映機體免疫活性狀態(tài)的特異性和非特異性免疫功能指標。結果顯示,口服型Poly1:C微囊所呈現(xiàn)的治療效果與其注射型可產生相同的誘導IFN-α的能力,說明Poly I:C微囊在內服吸收過程中,受到消化道中核苷酸酶降解的程度并不顯著；一定劑量范圍內,Poly I:C誘導產生IFN-α的能力與劑量成正比,但超過一定劑量范圍(0.2 mg/kg.bw)則可能產生抑制