功能內生菌強化植物修復重金屬污染土壤的作用與機制研究.pdf

1、土壤重金屬污染是當今世界上一個重要的環(huán)境問題，給人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成了極大風險。植物修復具有原位、成本低且環(huán)境友好的優(yōu)點，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ耐寥乐亟饘傥廴局卫硇录夹g。然而，這種基于植物的技術通常由于危害植物的毒性和有限的重金屬生物可利用性而導致修復效率較低，阻礙了它的大規(guī)模實際應用。因此，如何提高植物修復效率成為了目前國內外的研究熱點。其中，研究利用具有特殊生物學功能的微生物來協(xié)同植物提高修復效率成為目前最為活躍的領域之一。在此背景

2、下，本論文開展了功能微生物的篩選及其強化植物修復土壤重金屬污染的作用與機理的研究，從而為利用植物-微生物聯(lián)合修復技術修復土壤重金屬污染的實際應用提供優(yōu)良菌種資源、理論基礎和技術路線。
　　本文首先選定鎘(Cd)超累積植物龍葵及其內生細菌為研究植物-微生物聯(lián)合修復的材料和對象，通過對重金屬污染環(huán)境下龍葵內生菌群落結構和多樣性進行解析并研究其動態(tài)變化，獲得了龍葵內生細菌的種群結構特征及其與宿主植物、重金屬間的相互作用關系，并在此基礎上

3、分離篩選具有潛力的功能內生細菌應用于強化龍葵修復土壤重金屬污染，構建了新型高效的“龍葵-功能內生菌”的聯(lián)合修復載體，并深入探討了聯(lián)合修復過程中的功能內生菌與宿主植物間的相互作用機制。具體研究內容和結果如下:
　　(1)對重金屬污染條件下超累積植物龍葵內生細菌群落多樣性進行了解析，從而獲得了龍葵內生細菌的種群結構特征信息。16SrDNA克隆文庫及序列分析表明龍葵內生細菌群落多樣性豐富。其中占絕對優(yōu)勢地位的類群為變形菌門(Proteo

4、bacteria，61.93％)，包含α(41.12％)、β(6.09％)和γ(14.72％)亞類;另外還有放線菌門(Actinobacteria，18.78％)、擬桿菌門(Bacteroidetes，12.18％)、厚壁菌門(Firmicutes，2.03％)以及未被分類菌(Unclassifiedbacteria，5.08％);而優(yōu)勢種屬為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas），分別占克隆文

5、庫的24.37％和12.18％。此外，分別對龍葵根和莖的克隆子序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析比較發(fā)現(xiàn)龍葵根和莖中的內生細菌種類存在差異，表明不同的內生細菌通過自身定殖能力占據(jù)著不同的生態(tài)位。
　　(2)利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術對比分析了不同重金屬污染水平下龍葵內生細菌群落結構差異以及同一重金屬污染水平下龍葵與商陸內生細菌群落結構的差異，揭示了內生細菌群落與重金屬污染、宿主植物間的相互作用關系。不同重金屬污染水平會導致龍葵體內呈現(xiàn)

6、不同的內生細菌群落結構和組成，隨著重金屬污染程度的加劇會使有的物種消失，但也會使一些重金屬耐性菌群有增加的趨勢。同一重金屬污染水平下的龍葵和商陸的內生細菌群落的結構也存在較大差異。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）在龍葵內生細菌群落中占據(jù)優(yōu)勢地位，分別為總數(shù)的23.35％和12.18％;而在商陸內生細菌群落中，假單胞菌屬（Pseudomonas）和土壤桿菌屬（Agrobacterium）數(shù)量

7、最多，分別占到21.4％和12.44％。綜上所述，重金屬污染水平以及超累積植物類型的不同都會影響超累積植物內生細菌群落結構的多樣性。
　　(3)通過平板分離培養(yǎng)方法分析了龍葵重金屬抗性內生細菌多樣性并考察它們的功能性質和應用潛能。從生長于重金屬礦區(qū)的超累積植物龍葵體內分離篩選出具有多種重金屬抗性的純培養(yǎng)內生細菌30株，通過序列鑒定主要有微桿菌屬（Microbacterium），芽孢桿菌屬（Bacillus），節(jié)桿菌屬（Arthro

8、bacter），黃桿菌屬（Flavobacterium），金黃桿菌屬（Chryseobacterium），土壤農桿菌（Agrobacterium），鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），假單胞菌屬（Pseudomonas），沙雷氏菌屬（Serratia）以及短桿菌屬（Curtobacterium）等種屬。生物學特性表征發(fā)現(xiàn)具有產吲哚乙酸(IAA)、鐵載體和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶能力的內生細菌分別占到70％、50％

9、和56％，而具有固氮和增磷能力的菌株相對較少，分別只有10株和8株。功能內生菌株侵染龍葵幼苗的實驗發(fā)現(xiàn)某單個功能特性與幼苗生長參數(shù)間并沒有明顯的相關性，但當某菌株同時具備多種功能特性時則對幼苗的生長發(fā)育具有顯著的促進作用。
　　(4)將從龍葵體內分離篩選的4株兼具重金屬抗性和多種促生功能性質的內生細菌應用于重金屬污染修復實驗中，分析和探討了將這些功能菌株接種至原宿主龍葵強化其修復不同水平Cd污染土壤的效果與可能機制。結果表明，集產

10、IAA、分泌鐵載體以及ACC脫氨酶活性等能力于一身的促生功能內生細菌表現(xiàn)出了期望的促進龍葵生長增加生物量的作用。在12.1mg/kgCd污染土壤中，效果最為明顯的菌株為Enterobactersp.LSE04，接種該菌的龍葵地上部的高度、鮮重和干重比對照組分別提高了13.7％、28.2％和41.4％;在63.7mg/kgCd污染土壤中，效果最為明顯的菌株為Acinetobactersp.LSE06，接種該菌的龍葵地上部的高度、鮮重和干重

11、比對照組分別提高了10.9％、15.7％和23.1％;而在116.5mg/kgCd污染土壤中，接種SerratianematodiphilaLRE07的效果最為顯著，分別提高了18.9％、23.1％和19.8％。促生功能細菌的接種對龍葵根、莖、葉中Cd濃度也有一定提高，如在63.7mg/kgCd污染土壤中，促進效果最為明顯的菌株為LRE07，分別提高了21.3％、15.6％和11.9％。加之生物量的提高，接種了菌株的龍葵其體內累積的總C

12、d含量提高顯著，在63.7mg/kg污染下，接種LRE07對根部和地上部總Cd累積量為未接菌對照的1.69倍和1.37倍。綜上所述，將篩選的促生功能內生菌回殖龍葵提高了其修復Cd污染土壤的效率，在緩解重金屬壓力增加生物量的同時也促進了重金屬的吸收。
　　(5)將篩選的一株同時具有產鐵載體、產生物表面活性劑和代謝產酸功能的內生細菌Pseudomonassp.Lk9應用于強化Cd超累積植物龍葵修復Cd、Zn和Cu的多金屬復合污染土壤，

13、試驗評估了“Lk9-龍葵”復合修復載體的修復效果并探討了“Lk9-龍葵”的相互作用機制。研究結果發(fā)現(xiàn)，功能內生菌Lk9的接種能夠改善土壤中Fe和P等礦質營養(yǎng)元素的供應、提高土壤中重金屬的生物可利用性以及影響龍葵根系低分子量有機酸的分泌。與未接種的對照相比，Lk9的接種顯著增加了龍葵地上部生物量（地上部提高了14％）和重金屬的累積（地上部Cd、Zn和Cu的累積量分別提高了46.6％、16.4％和16％）。評估植物修復的效能發(fā)現(xiàn)，Lk9接種