OUT基因表達載體的構建及棉花黃萎菌轉化和基因沉默抑制功能初步研究.pdf

1、棉花黃萎病是世界上棉花作物的難治性病害。棉花黃萎菌病毒VdCV1本實驗室已經(jīng)報道,但對該病毒功能及其基因功能尚未做實驗研究。研究建立快速高效的黃萎菌遺傳轉化方法,進而建立真菌病毒ATMT法的侵染性克隆體系,對研究棉花、棉花黃萎菌以及棉花黃萎菌病毒三者之間的互作關系,以及對真菌病毒及其基因功能研究具有重要意義。本文為此作前期研究和探索。
　　 本研究首先以植物表達載體PH7WG2D為基本骨架,通過重疊PCR技術將病毒VdCV1的O

2、UT基因序列。VcR4進行改造,獲得含35S+VcR4+Ribozyme+Nos序列的attBPCR產(chǎn)物,通過Gateway技術的BP反應構建入門載體,入門載體與雙元表達載體pH7WG2D通過LR反應構建雙元表達載體PHVcR4,經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測序分析表明載體構建成功。然后,以植物表達載體PK7WG2D為基本骨架,通過同樣的方法改造潮霉素基因,使其含有trpC啟動子和Nos終止子,成功構建了雙元表達載體PKHyg。
　　

3、 利用低濃度放線菌酮處理結合菌絲尖端分離脫毒和光照培養(yǎng)的方法處理棉花黃萎菌0-21,經(jīng)過RT-PCR驗證得到脫病毒菌株0-21。以構建的載體PHVcR4、PKHyg轉化農(nóng)桿菌菌株GV3101,以及所購用于真菌農(nóng)桿菌介導轉化(ATMT)的載體pBHt1農(nóng)桿菌C58C1,采用ATMT法轉化棉花黃萎菌。結果顯示,PHVcR4質粒農(nóng)桿菌轉化黃萎菌獲得了具有綠色熒光的孢子和菌絲,但未能獲得具有抗性的轉化子,原因可能是表達質粒中的目的片段未能整合

4、到棉花黃萎菌基因組中,綠色熒光屬于GFP瞬時表達,或者可能是表達質粒中的目的片段整合進了棉花黃萎菌基因組,但啟動子未啟動潮霉素基因轉錄。PKHyg質粒農(nóng)桿菌轉化黃萎菌時在熒光倒置顯微鏡下未見到綠色熒光,抗生素篩選也未能獲得轉化子,可能與載體PK7WG2D不適合作為真菌轉化載體有關。pBHt1質粒農(nóng)桿菌轉化黃萎菌未能篩選到具有抗性的轉化子,可能與農(nóng)桿菌菌株為C58C1有關。黃萎菌的轉化有待進一步分析驗證和改進。
　　 采用瞬時表達