木霉REMI突變株的構建及磷脂酶A2基因的功能分析.pdf

1、木霉（Trichoderma spp.）作為一種重要的生物防治微生物，已普遍應用于各種作物病害的防治。然而在實際應用中發(fā)現(xiàn)，在病原菌侵染條件下，木霉與宿主植物之間存在復雜相互作用，尤其木霉-玉米之間的正向或負向互作對木霉誘導抗性有明顯影響，因此在病原菌侵染條件下，鑒定調控木霉-玉米互作的關鍵基因，對于揭示木霉誘導玉米抗病性分子機理具有重要意義。由于玉米彎孢霉葉斑病、小斑病和大斑病是我國玉米產區(qū)的主要葉斑病，因此本文重點開展兩部分工作，一

2、是通過REMI 技術，篩選具有抑菌活性的轉化子。二是從木霉-玉米互作角度分析木霉PLA2基因調控玉米抗葉斑病的分子機理。
　　 1、本研究首先通過REMI 插入突變技術，以T43 為出發(fā)菌，分別將pV4-GFP和pV4 轉化原生質體，獲得了9個含pV4-GFP的轉化子和250個含pV4的轉化子，經過繼代培養(yǎng)、PCR 擴增，證明線性質粒pV4-GFP和pV4 已成功插入木霉基因組DNA。
　　 將菌落形態(tài)發(fā)生較大變化的40

3、 株轉化子對玉米彎孢葉斑病菌（Curvularia lunata），禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），瓜類炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）進行拮抗活性測定，最終篩選到了5 株拮抗活性較高的轉化子，其對病原菌的生長抑制率顯著高于出發(fā)菌T43。
　　 2、鑒定了康氏木霉（Trichoderma koningii）T30中磷脂酶A2（PLA2）在調控玉米抗葉斑病中的作用。
　　

4、 利用已獲得的PLA2 敲除子，比較分析了敲除子與出發(fā)菌在生物學特性方面的差異。
　　 結果表明：PLA2 敲除子菌絲生長的最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為酵母浸出汁，在以蔗糖為碳源和KNO3 為氮源的培養(yǎng)液中產孢最多，且明顯高于出發(fā)菌產孢量。敲除子產生的外切幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活性均低于出發(fā)菌。敲除子處理玉米根系后，與出發(fā)菌株相比相對防治效果高達29.63％，玉米離體葉片經PLA2 原核表達產物處理后再接種彎孢霉，

5、病斑面積與對照相比有不同程度增加，推測PLA2 可能以負調控方式控制木霉對玉米彎孢霉葉斑病抗性反應。但該基因在木霉誘導玉米抗大斑病和小斑病過程中顯示出正調控作用，說明該基因的調控機理還與玉米病害的種類有關。
　　 開展了PLA2 負調控分子機理研究。結果表明：PLA2 敲除子處理玉米根系后，玉米葉片幾丁質酶、OPR2基因在RNA 水平表達量，防御酶系活性和SA 含量均比出發(fā)菌株有不同程度提高，而JA、ABA 含量呈降低趨勢，PA

6、L、APX、POX1、PR1、AOS、OPR7基因在RNA表達水平無顯著差異。PLA2 可能以負調控方式控制SA 在玉米葉片中的積累，而以正調控方式促進JA、ABA 積累。進一步通過蛋白質組學技術鑒定出發(fā)菌株T30及PLA2 敲除子的發(fā)酵液及菌絲差異蛋白，發(fā)現(xiàn)P82 與T30 發(fā)酵液中差異蛋白有5個；
　　 T30，P82菌絲總蛋白點分別為90、163個，二者的電泳圖譜有明顯差異。質譜鑒定成功的6個差異蛋白點中，有1個敲除子特異