神經(jīng)細胞的培養(yǎng)

1、哈爾濱醫(yī)科大學神經(jīng)生物教研室張彤帥,神經(jīng)細胞的培養(yǎng),2,主要內(nèi)容,體外培養(yǎng)的基本概念細胞培養(yǎng)的基本概念細胞培養(yǎng)的基本條件神經(jīng)元的原代培養(yǎng)混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)小結(jié),3,一、體外培養(yǎng)的基本概念,細胞培養(yǎng)（Cell culture）,在體外條件下，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使用培養(yǎng)液維持細胞生長與增值的技術(shù)。,4,體外培養(yǎng)的基本概念,組織培養(yǎng)（Tissue culture）,把活體的一小片組織（0.5~1立方毫米）置于底物上孵育，細

2、胞自其周圍移出并生長。,5,體外培養(yǎng)的基本概念,器官培養(yǎng)（Organ culture）,將活體中整個器官或一部分器官取出，置于體外生存、生長并同時保持其一定的結(jié)構(gòu)和功能特征。,6,二、細胞培養(yǎng)的基本概念,是指從體內(nèi)取出組織，分離細胞；或使用細胞系，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌，適當溫度和一定的營養(yǎng)條件下，使之生存和生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能特性。,7,細胞培養(yǎng)的基本概念,原代培養(yǎng)（Primary culture）,概念：取體內(nèi)新鮮組織，

3、并置于體外條件下生長的細胞，在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。優(yōu)點：組織細胞剛脫離機體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。,8,細胞培養(yǎng)的基本概念,傳代培養(yǎng)（Secondary culture）,原代培養(yǎng)的細胞或細胞系，在生長、繁殖到一定時間后，由于空間不足或細胞密度過大，導(dǎo)致營養(yǎng)枯竭，會影響細胞的生長，因此需要分開種到新的培養(yǎng)器皿中擴大培養(yǎng)。,9,細胞培養(yǎng)的基本概念,傳代培養(yǎng)注意事項,1.操作動作要準確敏捷，不能太快，

4、以防止空氣流動，增加污染機會。2.不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理 。3.瓶子開口后要盡量保持45°斜位。4.吸溶液的吸管不能混用。 。,10,細胞培養(yǎng)的基本概念,傳代培養(yǎng)注意事項,5.接種數(shù)量一般為5x104~8x105個/ml。6.傳代密度太低，細胞容易死亡，表現(xiàn)出細胞在達到增殖前有較長的滯留期。7.培養(yǎng)液由于pH下降呈黃色，若無污染需要換液或傳代。,11,細胞培養(yǎng)的基本概念,細胞系（Ce

5、ll line）,原代培養(yǎng)物首次傳代成功后即成細胞系。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，具有不死性和異體接種致瘤性。分類: 有限細胞系（Finite cell line） 無限細胞系（infinite cell line）,12,細胞培養(yǎng)的基本概念,細胞株（Cell strain）,由具有某些特性與標志的細胞，經(jīng)選擇或克隆化而派生的亞系，這些特性或標志在后續(xù)的培養(yǎng)中一直保持下去的細胞群。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原

6、株形狀不同的細胞群，稱之為亞株。,13,細胞培養(yǎng)的基本概念,細胞系或細胞株的命名,供體患者的姓名命名：HeLa(來源于宮頸癌)。組織來源命名：BHK 幼地鼠腎細胞（baby hamster kidney cell）。臨床疾病類型命名：BALL-1 來源于B淋巴細胞急性白血病人白細胞。時間地點命名：CHO 中國倉鼠卵巢細胞。 宮-743 宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立。,14,三、細胞培養(yǎng)的基本條件,無菌條件細胞生長

7、條件細胞檢測條件細胞保存條件,15,細胞培養(yǎng)的基本條件,細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境,無菌間結(jié)構(gòu)：更衣間，緩沖間和操作間。（使用前）紫外照射（15~30min）。每周使用甲醛熏蒸和每月用消毒液擦拭地面一次進行消毒。,16,細胞培養(yǎng)的基本條件,17,細胞培養(yǎng)的基本條件,超凈工作臺,工作原理：利用鼓風機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化過的空氣通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。,18,細胞培養(yǎng)的基本條件,超

8、凈工作臺的使用,使用前： 開啟柜內(nèi)紫外燈照射10~30min； 預(yù)工作2~3min，以除去臭氧和使工 作臺面、空間呈凈化狀態(tài)。使用完畢后： 要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)擦拭干凈。,19,細胞培養(yǎng)的基本條件,火焰消毒,在無菌環(huán)境下培養(yǎng)時，首先要點燃酒精燈，以后的一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼。注意事項：塑料和橡膠制品過火時要快速，不能長時間燒灼。,20,細胞培養(yǎng)的基本條件,培養(yǎng)器皿

9、的滅菌處理,壓力蒸汽消毒器：濕熱滅菌，壓力15磅，一般維持20~30min。滅菌前常用的包裝材料包括牛皮紙、硫酸紙和鋁飯盒。電熱干燥箱：干熱滅菌，溫度160~180℃，維持2h左右，主要用于玻璃器皿的滅菌。,21,細胞培養(yǎng)的基本條件,細胞培養(yǎng)的實驗用品,細胞培養(yǎng)瓶：25cm2，75cm2，150cm2,22,細胞培養(yǎng)的基本條件,細胞培養(yǎng)板：6孔、12孔、24孔、48孔和96孔（包括平底、U型和V型）。,23,細胞培養(yǎng)的基本條件,細胞培

10、養(yǎng)皿：35mm，60mm和100mm。,24,細胞培養(yǎng)的基本條件,凍存管：0.5ml，1.0ml，1.5ml和2.0ml,25,細胞培養(yǎng)的基本條件,離心管：10ml 15ml 50mlEP管： 200μl 500μl 1.5ml,26,細胞培養(yǎng)的基本條件,CO2培養(yǎng)箱設(shè)定條件溫度37℃，5% CO2含量。注意問題：1.螺旋口培養(yǎng)瓶，需

11、要將瓶蓋微松，以保證通氣。2.保證箱內(nèi)干凈。3.箱內(nèi)水槽內(nèi)定期更換滅菌蒸餾水，保持箱內(nèi)濕度。,CO2培養(yǎng)箱,27,細胞培養(yǎng)的基本條件,液氮罐,主要作用：凍存組織和細胞，保存凍存管。,28,細胞培養(yǎng)的基本條件,國外細胞庫,ATCC細胞庫（www.atcc.org） 美國菌種保存中心可提供以下物品： 細胞系3000種 細菌和噬菌體15000種 動植物病毒2500種 原生動物1200種歐洲動物細胞

12、庫（ECACC）日本細胞庫（RCB）,29,細胞培養(yǎng)的基本條件,國內(nèi)細胞庫,中國科學院細胞庫 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。中國典型培養(yǎng)物保藏中心 也稱武漢大學保藏中心 ，是國家知識產(chǎn)權(quán)指定的專利培養(yǎng)物/生物材料/菌種保藏機構(gòu)。,30,細胞培養(yǎng)的基本條件,細胞培養(yǎng)的常用液體,水(去離子水)平衡鹽溶液pH調(diào)節(jié)液消化液抗生素溶液培養(yǎng)基,31,細胞培養(yǎng)的基本條件,膠原酶I:用于上皮，肺，脂肪和腎上腺組

13、織細胞分離。膠原酶II:用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織細胞的分離。膠原酶III:消化組織中連接部分使其成為單個細胞。膠原酶IV:包含至少7中蛋白酶成分，能消化多種組織。膠原酶V：用于胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單細胞。,32,四、神經(jīng)元的原代培養(yǎng),組織來源,種屬：大鼠、小鼠、家雞等。年齡：一般為胚胎或新生動物組織。 神經(jīng)膠質(zhì)細胞：生后早期。 蒲肯野細胞：胚胎

14、末期。 內(nèi)皮細胞：生后兩周以內(nèi)。,33,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),常用試劑,培養(yǎng)液：DMEM/F12培養(yǎng)液。平衡鹽溶液：細胞PBS溶液。包被劑：多聚賴氨酸，處理培養(yǎng)瓶（皿）（10mg/L）。0.25%胰蛋白酶。神經(jīng)營養(yǎng)因子：成纖維生長因子（bFGF），腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），神經(jīng)細胞生長因子（B27）。,34,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,1.包被 培養(yǎng)前晚上將培養(yǎng)瓶（皿）用多聚賴氨酸包被1

15、0min，吸除，使用細胞PBS溶液清洗，無菌操作臺上自然晾干，置于培養(yǎng)箱中備用。,35,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),2.取腦 選取新生24h的小鼠數(shù)只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，斷頭處死，無菌條件下分層剪開頭皮、顱骨，用彎鑷拉開腦區(qū)視野，小心取出全腦，使用細胞PBS清洗數(shù)次。,實驗操作步驟,36,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,3.分離 以腦中線為起點，小心撥開大腦顳葉皮層，暴露出新月狀海馬回，小心夾出海馬組織，置于冰浴的PBS

16、溶液中，仔細剔除微血管，并充分剪碎組織。,37,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,4.消化 加入同體積0.125%的胰蛋白酶，瓶口用錫箔紙蓋上，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化20min左右，期間輕搖數(shù)次。,38,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,5.過濾 加入數(shù)滴胎盤牛血清終止消化，用尖頭吸管輕輕吹打細胞數(shù)分鐘，至液體成米糊狀即可停止吹打，動作要輕柔，用150目網(wǎng)篩過濾，收集細胞懸液。,39,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,6.接種

17、 以1100rpm離心5min，傾倒去上清，用DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞，輕輕吹打，臺盼藍染色快速計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，調(diào)整細胞終濃度為1x105/ml，加入終濃度為10%胎牛血清接種于培養(yǎng)瓶中，放于培養(yǎng)箱中，12h內(nèi)禁止晃動。,40,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),神經(jīng)元純化措施,消化前細心剔除微血管。過濾選擇150-200目篩網(wǎng)，使培養(yǎng)的細胞呈單個或數(shù)個成團。接種24h時需全量換培養(yǎng)基，除去未貼壁的死細胞。接種48h時加一定濃度的阿糖

18、胞苷，以抑制非神經(jīng)元細胞的過度生長。,41,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),神經(jīng)元顯微鏡下觀察,剛分離出的神經(jīng)元呈圓形，接種一般在2-6小時可貼壁。,42,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),神經(jīng)元顯微鏡下觀察,24h后可見細胞體積開始增大，生長良好的細胞可見胞體周圍明顯光暈，突起以單、雙突起為主。,43,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),神經(jīng)元顯微鏡下觀察,培養(yǎng)至4d，神經(jīng)元胞體明顯增大，形態(tài)多樣，有些已經(jīng)具有分枝的突起。,44,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),培養(yǎng)至7d后，神經(jīng)元形態(tài)基本成熟，

19、具有光滑的胞體，發(fā)育良好的突起。,神經(jīng)元顯微鏡下觀察,45,神經(jīng)元的原代培養(yǎng),神經(jīng)元的鑒定,神經(jīng)元的表面標記物一般選擇MAP-2。,46,五、混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),常用試劑,培養(yǎng)液：含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。平衡鹽溶液：細胞PBS溶液。包被劑：多聚賴氨酸，處理培養(yǎng)瓶（皿）（10mg/L）。0.25%胰蛋白酶。,47,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,1.取腦 取新生小鼠若干只（出生24h內(nèi)），,1.包被

20、 培養(yǎng)前晚上將培養(yǎng)瓶（皿）用多聚賴氨酸包被10min，吸除，使用細胞PBS溶液清洗，無菌操作臺上自然晾干，置于培養(yǎng)箱中備用。,48,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),2.取腦 選取新生24h的小鼠數(shù)只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，斷頭處死，無菌條件下分層剪開頭皮、顱骨，用彎鑷拉開腦區(qū)視野，小心取出全腦，使用細胞PBS清洗數(shù)次。,實驗操作步驟,49,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),3.分離 把全腦移入另一個盛有PBS液的培養(yǎng)皿中

21、，用小毛筆輕輕刷去腦表面的腦膜和血管，用PBS液沖洗后剪去腦干僅留大腦半球，并用剪刀剪碎腦組織。,實驗操作步驟,50,4.消化 加入比組織塊總量多30~50倍的0.05%胰酶，再移入50ml離心管，用吸管器反復(fù)吹打消化至肉眼觀察無明顯的腦組織團塊。,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,51,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),5.過濾 加入數(shù)滴胎盤牛血清終止消化，用尖頭吸管輕輕吹打細胞數(shù)分鐘，至液體成米糊狀即可停止吹打，動

22、作要輕柔，用150目網(wǎng)篩過濾，收集細胞懸液。,實驗操作步驟,52,6.接種 1000rpm/min，離心5min，棄上清，加定量完全培養(yǎng)液制成細胞懸液，根據(jù)實驗要求接種于培養(yǎng)瓶（皿）中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3d換液一次。,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,53,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),溫和胰酶消化法,目的：由于混合膠質(zhì)細胞中存在多種膠質(zhì)細胞，并且分層生長，根據(jù)不同種類細胞對胰酶的敏感度不同，使用胰酶消化法分離和純化混合膠質(zhì)細胞

23、中的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。,54,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)10~12d后，在倒置顯微鏡下可觀察到細胞生長出現(xiàn)分層現(xiàn)象。,55,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),實驗操作步驟,倒掉培養(yǎng)液，加入無血清DMEM培養(yǎng)液4:1稀釋后的胰酶-EDTA溶液，在37℃下作用25~40min。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，上層細胞與下層細胞分離。,56,實驗操作步驟,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),上層細胞：星形膠質(zhì)細胞。下層細胞：小膠質(zhì)細胞。,57

24、,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),星形膠質(zhì)細胞的鑒定,星形膠質(zhì)細胞的表面標記物一般選擇GFAP,58,混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),小膠質(zhì)細胞的鑒定,小膠質(zhì)細胞的表面標記物一般選擇Iba-1,59,神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)的意義,提供體內(nèi)生長過程在體外重現(xiàn)的機會。通過不同的技術(shù)手段直接觀察活細胞的生長、分化、形態(tài)和功能的變化。易于施行物理（如缺氧，缺血）、化學和生物因子的實驗條件，觀察條件變更對神經(jīng)細胞直接和間接作用。便于從細胞和分子水平探討某些神經(jīng)疾