第三章酶-安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院

1、Enzyme,第 三 章 酶enzyme,酶的概念,目前將生物催化劑分為兩類酶 、 核酶（脫氧核酶）,酶是一類由活細胞產(chǎn)生的，對其特異底物具有高效催化作用的蛋白質。,酶學研究簡史,公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。一百余年前，Pasteur認為發(fā)酵是酵母細胞生命活動的結果。1877年，Kuhne首次提出Enzyme一詞。1897年，Buchner兄弟用不含細胞的酵母提取液，實現(xiàn)了發(fā)酵。1926年，Sumner首次從刀豆中提

2、純出脲酶結晶。1982年，Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，Jack W.Szostak研究室首先報道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme)。,第一節(jié)酶的分子結構與功能The Molecular Structure and Function of Enzyme,酶的分類：,單體酶(monomeric enzyme)： 由單條

3、肽鏈構成,僅具有三級結構的酶。寡聚酶(oligomeric enzyme)： 由多個相同或不同亞基以非共價鍵連接組成的酶。多酶體系（multienzyme system)： 由幾種不同功能的酶彼此聚合形成的多酶復合物。多功能酶或串聯(lián)酶 (multifunctional enzyme or tandem enzyme)： 一些多酶體系在進化過程中由于基因的融合,(multienzyme system)：

4、 由幾種不同功能的酶彼此聚合形成的多酶復合物。,多酶體系,一些多酶體系在進化過程中由于基因的融合，多種不同催化功能存在于一條多肽鏈中，這類酶稱為多功能酶。由單肽鏈構成的，含有若干個酶活性的結構域,多功能酶或串聯(lián)酶(multifunctional or tandem enzyme)：,一、 酶的分子組成,,單純酶 (simple enzyme)結合酶 (conjugated enzyme),*各部分在催化反應中的

5、作用,酶蛋白決定反應的特異性輔助因子決定反應的種類與性質,金屬酶(metalloenzyme)金屬離子與酶結合緊密，提取過程中不易丟失。 金屬激活酶(metal-activated enzyme) 金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結合不甚緊密。,金屬離子的作用穩(wěn)定酶的構象； 參與催化反應，傳遞電子；在酶與底物間起橋梁作用；中和陰離子，降低反應中的靜電斥力等。,小分子有機化合物的作用在反應中起運載體的作用，傳遞電子、質

6、子或其它基團。,,,小分子有機化合物在催化中的作用,輔助因子分類（按其與酶蛋白結合的緊密程度）,,輔酶 (coenzyme):與酶蛋白結合疏松，可用透析或超濾的方法除去。,輔基 (prosthetic group):與酶蛋白結合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。,,輔酶的作用1參與基團的轉移:氨基------磷酸吡哆醛(Vit B6)羧基------生物素(biotin)、維生素K一碳單位------四氫葉酸(folic

7、 acid)甲基------維生素B12?；?----輔酶A、硫辛酸,輔酶的作用 2質子（氫原子 ）轉移:FAD+ ? FADH2NAD+ ? NADH + H+NADP+ ? NADPH + H+,酶的活性中心,,,二、酶的活性中心,必需基團(essential group)酶分子中氨基酸殘基側鏈的化學基團中，一些與酶活性密切相關的化學基團。,或稱活性部位(active site)，指必需基團在一級結構上

8、可能相距遙遠，但在空間結構上彼此靠近，組成具有特定空間結構的區(qū)域，能與底物特異結合并將底物轉化為產(chǎn)物。,酶的活性中心(active center),活性中心內(nèi)的必需基團,,,,位于活性中心以外，維持酶活性中心應有的空間構象所必需。,活性中心外的必需基團,,酶的活性中心常位于酶蛋白分子表面，為含有較多疏水氨基酸殘基，形成疏水性“裂縫”或“口袋”，形成了利于酶促反應發(fā)生的疏水環(huán)境,第二節(jié)酶促反應的特點與機理The Characteri

9、stic and Mechanism of Enzyme-Catalyzed Reaction,,酶與一般催化劑的共同點在反應前后沒有質和量的變化；只能催化熱力學允許的化學反應；只能加速可逆反應的進程，而不改變反應的平衡點。,（一）酶促反應具有高效性,一、 酶促反應的特點,酶的催化效率通常比非催化反應高108～1020倍，比一般催化劑高107～1013倍。酶的催化不需要較高的反應溫度。酶和一般催化劑加速反應的機理都是降低反應的

10、活化能(activation energy)。酶比一般催化劑更有效地降低反應的活化能。,,,,,,,,,,反應總能量改變,,,非催化反應活化能,,酶促反應 活化能,,,,,,一般催化劑催化反應的活化能,,,,,能量,反 應 過 程,底物,產(chǎn)物,酶促反應活化能的改變,活化能：底物分子從初態(tài)轉變到活化態(tài)所需的能量。,一種酶僅作用于一種或一類化合物，或一定的化學鍵，催化一定的化學反應并生成一定的產(chǎn)物。酶的這種特性稱為酶的特異性或

11、專一性。,,* 酶的特異性(specificity),（二）酶促反應具有高度的特異性,分類：,絕對特異性(absolute specificity)：只能作用于特定結構的底物，進行一種專一的反應，生成一種特定結構的產(chǎn)物 。 相對特異性(relative specificity)：作用于一類化合物或一種化學鍵。立體結構特異性(stereo specificity)：作用于立體異構體中的一種。旋光異構特異性幾何異構特異

12、性,立體異構特異性,旋光異構特異性：例如 ： L-乳酸脫氫酶 丙酮酸 L-乳酸 D-乳酸脫氫酶 丙酮酸 D-乳酸,,,酵母中的酶D-型葡萄糖 發(fā)酵 酵母中的酶L-型葡萄糖

13、 發(fā)酵 L-精氨酸酶L-精氨酸 L-鳥氨酸 + 尿素D-精氨酸,,,,,,,立體異構特異性,幾何異構特異性 延胡索酸酶 反丁烯二酸 蘋果酸 延胡索酸酶 順丁烯二酸,,,,（三）

14、酶促反應的可調(diào)節(jié)性,對酶生成與降解量的調(diào)節(jié)酶催化效力的調(diào)節(jié)通過改變底物濃度對酶進行調(diào)節(jié)等,酶促反應受多種因素的調(diào)控，以適應機體對不斷變化的內(nèi)外環(huán)境和生命活動的需要。其中包括三方面的調(diào)節(jié)。,二、酶促反應的機理,（一）酶-底物復合物的形成與誘導契合假說,*誘導契合假說(induced-fit hypothesis),酶底物復合物,酶與底物相互接近時，其結構相互誘導、相互變形和相互適應，進而相互結合。這一過程稱為酶-底物結合的誘導契合假說

15、 。,（三）與酶的高效率催化有關的機制：,1.鄰近效應與定向排列 2.多元催化：酸堿催化 3.表面效應：防止底物與酶之間形成水化膜,,1.趨近效應和定向效應,底物在活性中心聚集，局部微環(huán)境濃度? 催化基團定向催化反應,接受質子：堿 提供質子：酸 酶活性中心的某些基團可作為質子的供體或受體，從而對底物進行酸堿催化 如組氨酸的咪唑基, 解離常數(shù)為6.0，在生理pH下酸堿形式均可存在，很活躍 酸堿催化可參與多種

16、反應，如多肽的水解、酯類的水解、磷酸基的轉移,2. 多元催化（multielement catalysis）,酶活性中心疏水性“口袋” 防止底物與酶之間形成水化膜 有利底物與酶密切接觸,3. 表面效應 (surface effect),第三節(jié) 酶促反應動力學Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction,概念研究各種因素對酶促反應速度的影響，并加以定量的闡述。影響因素包括有酶濃度、底物濃度、

17、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。,,※ 研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。,一、底物濃度對反應速度的影響,單底物、單產(chǎn)物反應酶促反應速度一般在規(guī)定的反應條件下，用單位時間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示反應速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以內(nèi)）時的反應速度底物濃度遠遠大于酶濃度,研究前提,在其他因素不變的情況下，底物濃度對反應速度的影響呈矩形雙曲線關系。,,,當?shù)孜餄舛容^低時,反應速度與底物濃度成正比；反

18、應為一級反應。,,隨著底物濃度的增高,反應速度不再成正比例加速；反應為混合級反應。,當?shù)孜餄舛雀哌_一定程度,,反應速度不再增加,達最大速度;反應為零級反應,酶被底物飽和,底物對酶促反應的飽和現(xiàn)象：,（一）米－曼氏方程式,中間產(chǎn)物,酶促反應模式——中間產(chǎn)物學說,,※1913年Michaelis和Menten提出反應速度與底物濃度關系的數(shù)學方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelis equation)。,,,,[S]：底物

19、濃度V：不同[S]時的反應速度Vmax：最大反應速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelis constant),當 V= Vmax / 2 時,,Km值的推導,,Km＝[S],∴Km值等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。,（二）Km與Vmax的意義,Km值① Km等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度。② 意義：a) Km是酶的特征性常數(shù)之一；

20、 Km 只與酶的性質有關, 與酶的濃度無關b) Km可近似表示酶對底物的親和力（反比）c) 同一酶對于不同底物有不同的Km值。 確定最合適底物或天然底物,Km最小的底物大多數(shù)是此酶的天然底物 如：己糖激酶對葡萄糖的Km 1.5mmol/L 對果糖的Km 28mmol/L 所以葡萄糖為最適底物一種酶對每一種底物都各有一個特定的Km,Vmax定義：Vm是酶完全被底物

21、飽和時的反應速度，與酶濃度成正比。,意義：Vmax=K3 [E]如果酶的總濃度已知，可從Vmax計算 酶的轉換數(shù)(turnover number)，即動力學常數(shù)K3。,定義 — 當酶被底物充分飽和時，單位時間內(nèi)每個酶分子催化底物轉變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。意義 — 可用來比較每單位酶的催化能力。,酶的轉換數(shù),（三）Ｋm值與Ｖmax值的測定,1. 雙倒數(shù)作圖法(double reciprocal plot)，又稱為 林-貝氏(Linewea

22、ver- Burk)作圖法,,兩邊同取倒數(shù),2. Hanes作圖法,在林－貝氏方程基礎上，兩邊同乘[S],[S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax,,二、酶濃度對反應速度的影響,當[S]＞＞[E]，酶可被底物飽和的情況下，反應速度與酶濃度成正比。關系式為：V = K3 [E],,,,0,,,,,,,,,,,,,V,[E],當[S]>>[E]時，Vmax = k3 [E],酶濃度對反應速度的影響,雙重影響溫度升高

23、，酶促反應速度升高；溫度升高10oC, 反應速度增加一倍由于酶的本質是蛋白質，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應速度降低 。,三、溫度對反應速度的影響,最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應速度最快時的環(huán)境溫度。溫血動物：35～40℃Taq DNA聚合酶：70～75℃ 可耐受100℃高溫此酶是從水生棲熱菌 Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定

24、性DNA聚合酶，用于PCR反應。,低溫的作用 :貯存生物制品、菌種等 低溫時由于活化分子數(shù)目減少，反應速度降低，但溫度升高后，酶活性又可恢復。臨床上的低溫麻醉減少組織細胞的代謝程度，使機體耐受手術時氧和營養(yǎng)物質的缺乏,四、 pH對反應速度的影響,解離狀態(tài)： 蛋白質的極性基團 輔助因子的荷電狀態(tài) 底物的解離狀態(tài),而不同的解離狀態(tài)或直接影響酶與底物的結合, 或影響酶的空間結構, 從而改變酶的活力

25、,最適pH (optimum pH)：酶催化活性最大時的環(huán)境pH。多數(shù)酶：7.0左右胃蛋白酶：1.8肝精氨酸酶：9.8,選擇合適的緩沖液保持酶的相對穩(wěn)定和保持高活性,五、抑制劑對反應速度的影響,酶的抑制劑(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質稱為酶的抑制劑。,,,,區(qū)別于酶的變性,,抑制劑對酶有一定選擇性 引起變性的因素對酶沒有選擇性,抑制作用的類型,不可逆性抑制(irreversible

26、 inhibition),可逆性抑制 (reversible inhibition)：,競爭性抑制 (competitive inhibition)非競爭性抑制 (non-competitive inhibition)反競爭性抑制 (uncompetitive inhibition),(一) 不可逆性抑制作用,* 概念抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心的必需基團相結合，使酶失活。 * 舉例有機磷化合物 ?? 羥基酶

27、解毒 -- -- -- 解磷定(PAM)重金屬離子及砷化合物 ?? 巰基酶解毒 -- -- -- 二巰基丙醇(BAL),有機磷化合物,路易士氣,失活的酶,,羥基酶,失活的酶,酸,巰基酶,失活的酶,酸,BAL,巰基酶,BAL與砷劑結合物,（二） 可逆性抑制作用,* 概念抑制劑通常以非共價鍵與酶或酶-底物復合物可逆性結合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。,競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制,* 類型,１.

28、 競爭性抑制作用,反應模式,定義抑制劑與底物的結構相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶底物復合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競爭性抑制作用。,[S]>>[I]：高濃度的底物可解除抑制,,,特點,無抑制劑,⑴ 競爭性I往往是酶的底物結構類似物；⑵ 抑制劑與酶的結合部位與底物與酶的結合部位相同—— 酶的活性中心⑶ 抑制作用可以被高濃度的底物減低以致消除；⑷ (表觀）Km值增大，Vm值不變,* 舉例,丙二

29、酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶,,,磺胺類藥物的抑菌機制與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶,人體細胞的葉酸由食物獲得，不受磺胺類藥物的抑制,2. 非競爭性抑制,* 反應模式,I與酶的活性中心外的位點結合,非競爭性抑制的特點：⑴ 非競爭性抑制劑的化學結構不一定與底物的分子結構類似；⑵ 抑制劑與酶的活性中心外的位點結合；⑶ 抑制劑對酶與底物的結合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響； 抑制程度取決于抑制劑的濃度⑷ 動力學

30、參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。,３. 反競爭性抑制,* 反應模式,抑制劑不能與游離酶結合，但可與ES復合物結合,反競爭性抑制的特點：⑴ 反競爭性抑制劑的化學結構不一定與底物的分子結構類似；⑵ 抑制劑與底物可同時與酶的不同部位結合；⑶ 必須有底物存在，抑制劑才能對酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加； 抑制程度取決與抑制劑的濃度及底物的濃度⑷ 動力學參數(shù)：Km減小，Vm降低。,?,,,各種可逆性抑制作用的比較,,動

31、力學參數(shù),表觀,Km,K,m,增大,不變,減小,最大速度,V,max,不變,降低,降低,林,-,貝氏作圖,斜率,K,m,/,V,max,增大,增大,不變,縱軸截距,1/V,max,不變,增大,增大,橫軸截距,-,1/K,m,增大,不變,減小,與,I,結合的組分,E,E,、,ES,ES,作用特征,無抑制劑,競爭性抑制,非競爭性抑制,反競爭性抑制,,,,六、激活劑對反應速度的影響,激活劑(activator):使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富?/p>

32、性增加的物質。? 必需激活劑 (essential activator)? 非必需激活劑 (non-essential activator),七、酶活性測定和酶活性單位,酶的活性是指酶催化化學反應的能力，其衡量的標準是酶促反應速度。,酶促反應速度可在適宜的反應條件下，用單位時間內(nèi)底物的消耗或產(chǎn)物的生成量來表示。,酶的活性單位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在規(guī)定條件下，酶促反應在單位時間（s、min或h）內(nèi)生成一定量（mg、μ

33、g、μmol等）的產(chǎn)物或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量。,國際單位(IU)在特定的條件下，每分鐘催化1μmol底物轉化為產(chǎn)物所需的酶量為一個國際單位。,催量單位(katal)１催量(kat)是指在特定條件下，每秒鐘使１mol底物轉化為產(chǎn)物所需的酶量。,kat與IU的換算： 1 IU=16.67×10-9 kat,,第 四 節(jié) 酶 的 調(diào) 節(jié)The Regulation of Enzyme,調(diào)節(jié)對象 關鍵

34、酶,一 、酶活性的調(diào)節(jié),,（一）酶原與酶原的激活,酶原 (zymogen)有些酶在細胞內(nèi)合成或初分泌時只是酶的無活性前體，此前體物質稱為酶原。,酶原的激活在一定條件下，酶原向有活性酶轉化的過程。,,,,,,酶原激活的機理,,,,,胰蛋白酶原的激活過程,酶原激活的生理意義,消化道內(nèi)的蛋白酶原：避免細胞的自身消化，使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進行。凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解酶：有的酶原可以視為酶的儲存形式。在需要時，

35、酶原適時地轉變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。,（二）變構酶,變構效應劑 (allosteric effector),變構調(diào)節(jié) (allosteric regulation),變構酶 (allosteric enzyme),變構部位 (allosteric site),一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部分可逆地結合，使酶構象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱變構調(diào)節(jié)。,變構酶常為多個亞基構成的寡聚體，具有協(xié)同效應,,,變構激

36、活,,變構抑制,變構酶的Ｓ形曲線,無變構效應劑,,變構調(diào)節(jié)的方式：,變構酶通常為代謝途徑的起始關鍵酶，而變構劑則為代謝途徑的終產(chǎn)物。因此，變構劑一般以反饋方式對代謝途徑的起始關鍵酶進行調(diào)節(jié)，最常見的為負反饋調(diào)節(jié)。,變構調(diào)節(jié)的特點：,⑴ 酶活性的改變通過酶分子構象的改變而實現(xiàn)；⑵ 酶的變構僅涉及非共價鍵的變化；⑶ 調(diào)節(jié)酶活性的因素為代謝物；⑷ 為一非耗能過程；⑸ 無放大效應。,（三） 酶的共價修飾調(diào)節(jié),共價修飾(covalent

37、modification)在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽鏈上的一些基團可與某種化學基團發(fā)生可逆的共價結合，從而改變酶的活性，此過程稱為共價修飾。,常見類型磷酸化與脫磷酸化（最常見）乙?；兔撘阴；谆兔摷谆佘栈兔撓佘栈璖H與－S－S互變,酶的磷酸化與脫磷酸化,引起酶分子在有活性形式與無活性形式或者高活性與低活性之間進行相互轉變,共價修飾調(diào)節(jié)的特點：,⑴ 酶以兩種不同修飾和不同活性的形式存在；⑵ 有共價鍵的變

38、化；⑶ 一般為耗能過程⑷ 受其他調(diào)節(jié)因素（如激素）的影響⑸ 存在放大效應,二、 酶含量的調(diào)節(jié),（一）酶蛋白合成的誘導和阻遏誘導作用(induction)：誘導物使酶合成增加的過程阻遏作用(repression)：阻遏物使酶合成減少的過程（二）酶降解的調(diào)控,降解：使酶的半壽期發(fā)生改變 酶的降解就是蛋白質和氨基酸分解代謝的過程,酶的誘導和阻遏、降解,基因 調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物，封閉基因

39、 誘導物： 使封閉物失效 阻遏物：增加封閉物活性 轉錄mRNA 翻譯蛋白質,,,,,,,,三、 同工酶,* 定義同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化學反應，而酶蛋白的分子結構理化性質乃至免疫學性質不同的一組酶。,,國際生化學會：由不同基因或者等位基因編碼的多肽鏈由同一基因編碼，生成不同的mRNA翻譯而來的不包括翻譯水平修飾所形成的多分子形

40、式同工酶：通常存在于同一種屬或者同一個體的不同組織或者細胞的不同亞細胞結構中,*生理及臨床意義在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用；用于解釋發(fā)育過程中階段特有的代謝特征；同工酶譜的改變有助于對疾病的診斷；同工酶可以作為遺傳標志，用于遺傳分析研究。,* 舉例：乳酸脫氫酶(LDH1～ LDH5),心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化,1,酶活性,,,,,,心肌梗死酶譜,正常酶譜,肝病酶譜,2,3,4,5,第五節(jié) 酶的命名與分類T

41、he Naming and Classification of Enzyme,一、酶的命名1. 習慣命名法——推薦名稱2. 系統(tǒng)命名法——系統(tǒng)名稱,一些酶的命名舉例,二、酶的分類1.氧化還原酶類(oxidoreductases)2.轉移酶類 (transferases )3.水解酶類 (hydrolases)4.裂解酶類 (lyases)5.異構酶類( isomerases)6.合成酶類 (ligases, synth

42、etases),,系統(tǒng)命名法： EC:1. 4. 1. 3 EC ---- enzyme commission 1. ---- 類 （氧化還原酶類） 4. ---- 亞類 1. ---- 亞-亞類 3. ---- 亞-亞類中的排序,第六節(jié)酶與醫(yī)學的關系The R

43、elation of Enzyme and Medicine,（一） 酶與疾病的發(fā)生（二） 酶與疾病的診斷（三） 酶與疾病的治療,一、酶與疾病的關系,二、酶在醫(yī)學上的其他應用,（一）酶作為試劑用于臨床檢驗和科學研究,1．酶法分析 即酶偶聯(lián)測定法(enzyme coupled assays)，是利用酶作為分析試劑，對一些酶的活性、底物濃度、激活劑、抑制劑等進行定量分析的一種方法。,最簡單的酶偶聯(lián)反應模式：,A B

44、 C,,,Ex,Ei,2．酶標記測定法 酶可以代替同位素與某些物質相結合，從而使該物質被酶所標記。通過測定酶的活性來判斷被標記物質或與其定量結合的物質的存在和含量。,酶聯(lián)免疫測定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),3．工具酶 除上述酶偶聯(lián)測定法外，人們利用酶具有高度特異性的特點，將酶做為工具，在分子水平上對某些生物大分子進行定向的分割與連接。,（二）酶作為藥物用于臨床治療

45、,（三）酶的分子工程,1．固定化酶 (immobilized enzyme),將水溶性酶經(jīng)物理或化學方法處理后，成為不溶于水但仍具有酶活性的一種酶的衍生物。 固定化酶在催化反應中以固相狀態(tài)作用于底物，并保持酶的活性。,2．抗體酶,抗原－抗體 底物－酶 以底物的過渡態(tài)類似物為抗原，制備抗體，則這種抗體與底物的結合，可能會引起催化反應，這種具有催化功能的抗體分子稱為抗體酶(abzyme),3．模擬酶,模擬酶是根據(jù)