MIR156調控植物鎘脅迫耐受機制研究及應用.pdf

1、利用植物修復土壤污染是一種新興的環(huán)境生物技術，其研究的基礎是超積累植物(hyperaccumulator)的發(fā)現(xiàn)和應用，但超積累植物大都具有生物量相對較小、根系不夠發(fā)達等缺陷，不能投入到大型生產實踐中。MIR156作為植物生長發(fā)育的重要調控因子，可以調控植物生長周期、生物量及根系發(fā)育等。本研究首先以擬南芥為試驗材料，采用基因敲除和過表達技術，產生過表達MIR156擬南芥植株（35S∷MIR156A）和MIM156敲除擬南芥植株(Ubi1

2、0∷MIM156)，并研究它們對Cd脅迫的耐受表型及耐受機制。然后，選擇鎘超累積植物伴礦景天，開展MIR156調控植物鎘脅迫耐受機制研究成果的應用，即在伴礦景天愈傷組織上，進行MIR156的過表達和敲除，以探究MIR156-SPLs網(wǎng)絡途徑調控下植物相關鎘耐受和富集差異，解析MIR156-SPLs信號途徑改良伴礦景天的可行性。主要結論如下:
　　(1)擬南芥植株真葉長出后轉基因植株與野生型植株表型逐漸表現(xiàn)出不同，35S∷MIR15

3、6A葉片發(fā)生速率明顯快于WT，并且下表皮毛發(fā)生顯著晚于WT，葉片較圓缺刻少，開花延遲。Ubi10∷MIM156表現(xiàn)出快速成熟的表型，葉片數(shù)量低于35S∷MIR156A和WT，葉片缺刻多。
　　(2)為了研究MIR156在擬南芥響應鎘脅迫的過程中的作用，首先觀察鎘脅迫處理擬南芥的表型和損傷等級，統(tǒng)計結果顯示，相比WT，MIR156過表達的植株35S∷MIR156A在遭受鎘脅迫后損傷較輕，而MIR156敲除的植株Ubi10∷MIM15

4、6易發(fā)生嚴重的鎘脅迫損傷表型。
　　(3)擬南芥地上、地下的Cd含量的測定結果表明，根部鎘的吸收量:35S∷MIR156A＞Ubi10∷ MIM156＞ WT;而地上部分的鎘含量與地下不同，Ubi10∷MIM156＞ WT＞35S∷MIR156A。雖然Ubi10∷ MIM156地下的鎘吸收量最低，35S∷MIR156A植株最高，但是地上部分的鎘含量卻與地下部分相反，這表明Ubi10∷MIM156鎘轉運效率明顯高于WT和35S∷.M

5、IR156A，本研究結果表明MIR156可參與調控植物鎘吸收轉運過程。
　　(4)為了闡明Cd在擬南芥MIR156過表達植株35S∷MIR156A和MIR156敲除的植株Ubi10∷MIM156中的分布差異的分子機制，測定了ABC轉運子(ATP-binding cassette transporters)、HAM(heavy metal ATPases)和ZIP(Zrt/Irt-likeProtein)等多個Cd轉運子基因的表達量

6、。結果顯示，負責將根部的Cd轉運進入根部細胞的重金屬轉運子ZIP1-4和將根部細胞內的Cd運輸進入液泡的ABCC1基因在35S∷MIR156A中的表達量均明顯高于WT，而在Ubi10∷MIM156中明顯低于WT。莖中負責將Cd運輸?shù)降厣喜糠值腍MA4基因的表達量為:Ubi10∷MIM156＞35S∷MIR156A＞W(wǎng)T?；诖?，結合三種材料地下地上部分鎘積累結果，推測35S.∷MIR156A材料中，鎘吸收進入根內細胞多，大量鎘被運輸固定

7、在細胞液泡中，同時莖的向上運輸能力降低，最終導致根部鎘的超量積累。
　　(5) MIR156在植物發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。在正常生長條件和5μM硫酸鎘脅迫下，均為35S.∷MIR156A生物量明顯高于WT，Ubi10∷MIM156顯著低于WT。35S∷MIR156A植株的側根數(shù)量明顯高于WT和Ubi10∷MIM156植株，而35S∷MIR156A根系覆蓋廣。Ubi10∷MIM156的主根根長明顯長高于WT和35S∷MIR156A

8、，表明該Ubi10∷MIM156更有利于修復深層土壤。
　　(6)以伴礦景天葉片為外植體，使用添加了300mg/L的水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，建立了再生體系，為伴礦景天遺傳轉化提供受體材料。結果表明:愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為:2，4-D1mg/L+6-BA0.3mg/L，誘導率為9201％;最優(yōu)分化培養(yǎng)基為:2，4-D0.1mg/L+6-BA1mg/L，分化率為27.44％;適宜的芽增殖培養(yǎng)基為:2，4-D0.1mg/L

9、+6-BA0.5mg/L;適宜的生根培養(yǎng)基為:IBA1-2mg/L。伴礦景天的抗生素敏感性實驗表明:適合伴礦景天愈傷組織遺傳轉化的抗生素類型為G418（慶大霉素衍生物），臨界濃度為40mg/L，篩選時間為20天。
　　(7)以包含NPTII（氨基糖苷類-3-磷酸轉移酶）抗性標記基因的植物表達載體PBI21為骨架，構建了MIR156A超表達載體(MIR156PBI)和靶基因模擬Mimicry156表達載體(MIMPBI)。將PBI1

10、21空載、MIR156PBI、MIMPBI載體借助基因槍轟擊伴礦景天愈傷組織，經(jīng)過G418多代篩選獲得抗性愈傷組織。結果表明:轉入MIR156PBI載體的愈傷組織鮮重增長最快、空載體次之、轉入MIMPBI載體的愈傷組織增長最慢。
　　(8)用1000μMCdSO4和0μMCdSO4處理條件下愈傷組織的鮮重增長率的比值衡量Cd脅迫對伴礦景天愈傷組織的影響，轉PBI121、MIR156PBI、MIMPBI載體的比值為0.49、0.66