單核細胞增生李斯特菌檢驗

1、食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢驗,,李斯特氏菌屬,李斯特氏菌屬（Listeria ）普遍存在于環(huán)境中，最新的分類學研究表明，其分為六個種：單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii）英諾克李斯特氏菌（Listeria innocua）斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri）格氏李斯特

2、氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌屬的六個種中，只有兩種致病菌：單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他動物發(fā)病。但是，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥（listeriosis）相關。因此，李斯特氏菌中最有檢測意義的是單核增生李斯特氏菌。,單增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和流產等。它廣泛存在于自然界中。肉類、蛋類、禽類、海產品、

3、乳制品、蔬菜等都可被污染。該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。其易感人群主要為孕婦、老人、新生兒和免疫缺陷人群。大多數(shù)發(fā)達國家人類李斯特菌病發(fā)生率約為每一百萬人2-15例，死亡率為13-34%加拿大由單增李斯特氏菌污染肉制品引發(fā)李斯特菌病暴發(fā)，導致十幾人死亡。很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的單增李斯特氏菌，并制定了相應的標準。,按2009年國家食源性疾病檢測網(wǎng)的工作手冊1.定性檢測2.定

4、量檢測,檢樣25 g(ml)樣品+LB1增菌液225 mL，均質,,0.1 mL+10 mL LB2增菌液,,,,,科瑪嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基,PALCAM瓊脂,,,接種木糖、鼠李糖，36 ℃±1 ℃，24 h；同時于TSA-YE平板劃線純化，30 ℃±1 ℃，24 h～48 h,木糖-，鼠李糖+,,鑒定,結果報告,30 ℃±1 ℃，24 h,30 ℃±1 ℃，18 h～24 h,36 ℃

5、7;1 ℃，24 h～48 h,增菌培養(yǎng):LB1增菌液225 mL，于30℃培養(yǎng)24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。分離培養(yǎng):LB2 二次增菌液轉種于選擇培養(yǎng)基PALCAM和科瑪嘉瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上的菌落特征見表1。,表1 單核細胞增生李斯特菌在選擇性平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板單核細胞增生李斯特菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基菌落為:藍色，周圍有白色暈圈.P

6、ALCAM瓊脂菌落:為灰綠色，小的圓形菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷,L.M在 Chromagar培養(yǎng)基生長特征,,L.M在OXA培養(yǎng)基生長特征,L.M在PALCAM培養(yǎng)基生長特征,MMA抑制性強，菌落小、形態(tài)不典型，很難與雜菌區(qū)分進口PALCAM 、進口OXA菌落較典型，易與雜菌區(qū)分CHROMagar菌落較典型，易與雜菌區(qū)分，對高污染食品中的雜菌抑制性較差,染色鏡檢將上述可疑純培養(yǎng)物做革蘭氏染色并做濕片檢查; 利斯

7、特菌為革蘭氏陽性短桿菌, 大小為0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理鹽水制成菌懸液, 在油鏡或相差顯微鏡下觀察, 該菌出現(xiàn)輕微旋轉或翻滾樣的運動。,該菌為革蘭氏陽性無芽孢桿菌，在純培養(yǎng)物中呈短小桿菌，在初齡培養(yǎng)物中呈球桿菌狀，在老齡培養(yǎng)物中呈長絲的長桿菌狀，有些細菌因此而變成革蘭氏陰性；為需氧或兼性厭氧菌，在20～25℃培養(yǎng)時能形成4根鞭毛，運動活潑；在37℃培養(yǎng)時無鞭毛，運動消失。,1.初篩 在我們前期工作

8、中發(fā)現(xiàn)，高污染樣品在選擇性瓊脂平板上可疑菌落較多，為避免漏檢和減少工作量，增加初篩步驟：挑取典型或可疑菌落接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管中，無須燒環(huán)同時TSA-YE平板上劃線分離純菌。,初篩及純培養(yǎng)自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個以上典型或可疑菌落，分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于37℃培養(yǎng)24h；同時在胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA-YE）平板上劃線純化，于30℃培養(yǎng)24h-48h。木糖陰性為藍色，鼠李糖陽性為黃色，在TSA-YE平板上可疑菌

9、落為淡藍色。,單增李斯特氏菌生化性狀與其種間的區(qū)別,動力試驗將TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接種到SIM培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)24h-48h，李斯特菌有動力，呈傘狀生長。溶血實驗：將7%羊血瓊脂平板底面劃分為20-25個小格，從TSA-YE上挑取菌落刺種到血平板上，每格刺種一個菌落，并刺種陽性對照菌(單增李斯特菌和綿羊李斯特菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特菌)，,于35℃培養(yǎng)24h-48h，穿刺時盡量接近底部，但不要觸到底面，同時

10、避免瓊脂破裂。 于明亮處觀察潔凈的血瓊脂平板，單增李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺種點周圍產生狹小的透明溶血環(huán)，無害李斯特菌無溶血環(huán)，伊氏利斯特菌產生大的透明溶血環(huán)。注意：不要據(jù)此來區(qū)別李斯特氏各種菌，僅僅是一種溶血現(xiàn)象。用CAMP試驗來確證李斯特氏各種菌。,協(xié)同溶血試驗 (cAMP):在血平板上平行接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌 (R.equi), 在它們中兩者之間垂直接種可疑李斯特菌, 但不要觸及它們, 于30℃培養(yǎng)24h～48 h, 檢

11、查平板中垂直接種點對溶血環(huán)的影響?？拷瘘S色葡萄球菌接種點的單核細胞增生李斯特菌的溶血增強, 斯氏李斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增強, 而伊氏李斯特菌（L.ivanovii）在馬紅球菌附近的溶血增強。,金葡,單核,馬紅,伊氏李,對小鼠的毒力試驗 （可選擇） 將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于TSB-YE中, 于30℃培養(yǎng)24 h, 離心, 棄上清液，用0.85?無菌生理鹽水制備成濃度為1010cfu/mL的菌懸液, 取此

12、菌懸液進行小鼠腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，觀察小鼠死亡情況。致病株于2～5d 內死亡。試驗時可用已知菌作對照。單核細胞增生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）對小鼠有致病性。,血清學分型:  Lm是根據(jù)O抗原和H抗原的差異進行血清學分型。雖然Lm有16種血清型，1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b和7，但只有3種血清型 (1/2a、1/2b

13、、4b)可引起疾病。從食品和患者中分離的菌株95％以上是1/2a，1/2b，1/2c和4b等血清型，而3a、3b、3c、4a、4c、4e、4d和7等血清型在食品中非常少見，也沒有引起李斯特菌病的報道。,一方面血清是進口的，無國產的；另一方面只存在“O”抗原因子血清，并且各型之間含有多種共同的抗原因子，因此其血清學上鑒別意義不大。,2.商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)的應用 原國標中未涉及，F(xiàn)DA、AOAC標準使用API 10300?、Vitek G

14、NI?（AOAC 989.13），這些方法都比較成熟，穩(wěn)定性較好，已被許多國家和組織的標準采用。我國許多單位也積累了較多的經(jīng)驗，使用最廣泛的是API 10300?, Vitek GNI?，考慮到各種系統(tǒng)在國內的實際應用現(xiàn)狀，擬定在生化鑒定方面“采納API10300?或Vitek GNI?為傳統(tǒng)生化鑒定方法的選擇性替代方法”。,API10300,L.M的API10300鑒定結果,,單增李斯特菌編碼:2410、2510、2550、601

15、0、6110、6150、6410、6450、6510,,VITEK,采用聚合酶鏈式反應技術（PCR）特異性擴增單核細胞增生李斯特氏菌溶血素基因(hlyA)，并評價該方法的特異性與敏感性。 結果 在706bp處出現(xiàn)nuc基因的目的片斷，只有單增李氏菌的目的片段獲得擴增其它菌種擴增均呈陰性；該方法可以檢測到3.3pg/μl的DNA。,引物 針對單核細胞增生李斯特氏菌溶血素基因（hlyA）設計引物，委托上海生物工程技術服務有限公司合成。單核

16、細胞增生李斯特氏菌特異性引物序列如下：上游（F）：5´--GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC—3´下游（R）： 5´--CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC--3´,（3）擴增條件：預變性94℃ 5min，變性95℃60s退火 63℃ 60s ，延伸72℃ 60s 30個循環(huán)，再延伸72℃8min，20℃ pause。（4）結果觀察：PCR產物用1.5％瓊