誘變物質的微核測試及其應用

1、設計性實驗,小組成員：黃金匯 魏青 卞徐磊 唐曉婧 劉欣欣 周偉 徐振揚,2008年10月,生技0611 第5組,誘變物質的微核測試及其應用,本實驗通過用實驗室自來水（對照組）、洗滌劑、新校區(qū)河道污水、一定范圍內不同濃度的硫酸銅溶液處理蠶豆根尖，通過觀察計數后計算蠶豆根尖細胞微核千分率得出樣品溶液污染指數。,摘要,結果表明：七種處理液處理后的蠶豆根尖細胞的微核千分率分別為2.00‰、2.67‰、4.67‰、3.67‰ , 4.00‰，

2、5.33‰，6.33‰ 六種樣品污染指數分別為1.33，2.33，1.83，2.00，2.67，3.17。這表明學校新校區(qū)存在中度污染，應注意環(huán)境的保護。,前言：隨著科技的飛速發(fā)展，不斷有新的化學物質和“工業(yè)三廢”進入我們的生活，它們中許多都是“致畸、致癌、致突變”的物質，可以對人類健康產生巨大的威脅。微核試驗(micronucleus test，MCNT)是以動植物為材料，觀測材料細胞出現的微核率來表示材料受遺傳損傷程度從而檢測遺傳

3、毒物的一種方法。在各種微核實驗中，常采用蠶豆(vcia faba)根尖細胞微核法，蠶豆根尖細胞微核試驗(Mircronu—cleus test，簡稱MCNT)技術是一種以染色體損傷及紡錘絲毒性等為測試點的植物微核檢測方法，此可用微核率大小來表示誘變因子的強弱。我國科學家陳光榮在I983年開始用蠶豆根尖微核技術(Vicia MCN)來檢測農藥和化學誘變劑對染色體的損傷情況。目前利用蠶豆初生根尖微核技術監(jiān)測環(huán)境污染和危險化學品的研究已得到了

4、廣泛的應成為我國水環(huán)境監(jiān)測的規(guī)范化方法之一[2]；利用蠶豆根尖細胞微核技術以下優(yōu)越性：方法簡便，鑒別客觀，易于掌握，不需要特殊的儀器和藥品，敏度高，可靠性強；而且有顯而易見的實用性，且蠶豆根尖細胞周期中大部分時間處于對誘變劑敏感的間期，便于遺傳毒性檢測試驗，精確度也比較高，現已廣泛地應用于污水的檢測。本實驗就是利用蠶豆根尖微核檢測技術對新校區(qū)河道污水水質污染，生活用品，化學用品的情況進行評價。,關鍵詞： 蠶豆 微核 污染指數,

5、一、實驗目的：☆了解細胞微核形成的機理及其形態(tài)特點☆學習植物根尖細胞的微核測試技術☆進行小組合作，掌握設計實驗基本能力,正文 : 實驗設計 ，實驗過程等,二、實驗原理： 微核是真核細胞中的一種異常結構，往往是細胞經輻射或化學藥物的作用而產生。在細胞間期微核呈圓形或橢圓形，游離于主核外，大小應在主核1/3以下，微核測試是一種以染色體損傷及紡錘絲毒性等為測試點的微核檢測方法，用微核率大小表示誘變因子強弱，經證實微核率大

6、小和用藥的劑量或輻射累積效應呈正相關。,三、實驗材料：蠶豆 實驗用具和藥品：●顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、濾紙、電子天平、試管、鑷子、 廣口瓶、脫脂棉等；●無水乙醇、冰醋酸、改良石炭酸品紅染液、HCl等；●洗滌劑，新校區(qū)河道污水、硫酸銅。,四、實驗過程：,1.浸種催芽（10月1日-6日） 選擇無蟲、飽滿、大小均勻的蠶豆種子40粒放入盛有自來水的培養(yǎng)皿中， 25℃浸泡24h,其中換水2次。種子吸脹

7、后，在培養(yǎng)皿中鋪一層脫脂棉，倒入少量自來水，將種子置于其中培養(yǎng)5天，大部分初生根長至1～2cm左右。,2.處理液的配置◇對照組自來水直接由實驗室取得；◇配制12.5mg/L,25mg/L,50mg/L,100mg/L四種濃度的硫酸銅溶液；◇取洗滌劑稀釋5倍備用；◇取新校區(qū)河道污水稀釋5倍備用。,四、實驗過程：,3.處理（10月7日12：30-16：30） 用上述七種處理液處理根尖，每一處理選取4-5粒初生根良好、根長較一

8、致的種子，置于盛有被檢測液的培養(yǎng)皿中，被測液浸沒根尖即可，貼上標簽，處理4h。,4.根尖細胞恢復培養(yǎng)（10月7日17：00-10月8日16：00） 處理后的種子用蒸餾水浸洗三次，每次2～3分鐘。洗凈后置于鋪有脫脂棉的培養(yǎng)皿中，加自來水于25℃恒溫箱中恢復培養(yǎng)23h。,5.根尖細胞固定（10月8日16：30-10月9日13：30） 將恢復培養(yǎng)后的種子，從根尖頂端切下1cm長的幼根放入廣口瓶中，以無水乙醇：冰醋酸=3：1的比

9、例配制卡諾氏固定液，倒入廣口瓶進行固定21h。,四、實驗過程：,6.解離、染色、壓片 用蒸餾水浸洗固定好的幼根兩三次，每次3分鐘，吸去蒸餾水，加入1mol/L鹽酸將幼根浸沒，于60℃水浴解離20分鐘，幼根軟化即可。然后吸去鹽酸，用蒸餾水浸沒清洗幼根三次，每次1～2分鐘。在凹面玻片內滴加改良石炭酸品紅染液，染色10分鐘，制片前取出置載玻片上，截下1～2mm左右長的根尖，滴改良石炭酸品紅染液，加上蓋玻片，覆一層吸水紙，用解剖針或鑷子

10、垂直敲打，然后以拇指垂直緊壓蓋片（注意勿使蓋片搓動），使材料分散壓平，便于觀察。,7.鏡檢觀察計數 在常規(guī)制片后，將玻片標本放在顯微鏡的低倍鏡下觀察，找到分生組織區(qū)細胞分散良好、核膨大、分裂相對較多的部分轉到高倍鏡下進行觀察。在顯微鏡下觀察微核個數，數900～1000個蠶豆根尖細胞，記下含有微核的個數，計算出各個處理的蠶豆根尖微核千分率（MCN ‰）并與自來水對照組相比得出污染指數（PI）。,五、數據分析方法：,根據觀測結果，計

11、算各處理下微核的千分率，并根據下述算式計算各處理的微核率污染指數：◆微核率（MCN‰）=測試樣品（或對照）觀察到的微核個數/測試樣品（或對照）觀察細胞總數×1000‰ ◆污染指數（PI）=樣品微核千分率平均值/對照水樣微核千分率平均值 污染指數在0～1.5區(qū)間，基本沒有污染，在1.5～2區(qū)間,為輕度污染,在2～3.5區(qū)間為中度污染，在3.5以上為重度污染。,六、結果與分析：,1. 實驗結果,各檢測樣本引起的

12、蠶豆根尖細胞微核率的鏡檢結果記載表,六、結果與分析：,從表中可以看出：▲新校區(qū)河道污水在稀釋了5倍后為中度污染， ▲100.0mg/L的硫酸銅溶液污染指數最大，表明其對供試材料有較強烈的致畸作用?！廴境潭刃滦^(qū)河道污水>洗滌劑>自來水▲通過本實驗對不同濃度硫酸銅溶液微核率的檢測可推斷硫酸銅濃度在0-100mg/L間微核率與溶液濃度呈正相關。,六、結果與分析：,2. 分析討論,誤差分析：處理時間較短

13、，僅4小時，檢測的微核率較小；鏡檢時，由于細胞數量較多，視野較小，在數數上也存在一定誤差。,選材：由于蠶豆易于培養(yǎng)，對誘變物質敏感等優(yōu)點，所以選擇蠶豆為本次實驗材料。選擇洗滌劑是因為想了解日常用品的污染指數、對我們皮膚等的傷害，由于蠶豆數量有限，放棄了對洗衣粉，消毒液等的檢測而選擇了洗滌劑作為代表。另外，我們還想了解重金屬離子對蠶豆根尖的毒害作用，但擔心濃度過高會殺死根尖，因此配制0-100mg/L的四個濃度梯度的硫酸銅溶液進行實驗。這

14、樣可以在橫向核縱向上對蠶豆實驗以得出較好的結果。,污染問題：通過本次實驗，我們發(fā)現洗滌劑在稀釋了5倍后基本沒有污染，平時使用中稀釋倍數更大，因而安全性較好，而新校區(qū)河道污水在稀釋了5倍后為中度污染，可以認為未稀釋的水污染比較嚴重，經過分析討論認為主要是新校區(qū)的建設還未完成，施工對河道產生污染，此外還有宿舍樓的生活污水也對其有危害。,六、結果與分析：,3. 思考與建議,在實驗過程中我們想到用孔板法培養(yǎng)蠶豆，但由于實驗器材的限制，我們在培養(yǎng)

15、中將脫脂棉摳了幾個洞便于培養(yǎng)以代替孔板的效果；,考慮到用被測液處理蠶豆根尖的時間長短可能會影響微核率，但由于材料數量的限制等因素沒有去實踐，建議以后實驗中把它加入；,用蠶豆實驗測試河道污水準確度不大，存在一定的缺點，因而要準確掌握污染源的污染程度，應用生物毒性測試與理化監(jiān)測相結合，以便有效地采用相應措施保護水資源。,六、結果與分析：,結語： 蠶豆根尖微核試驗是一種以染色體損傷及紡錘絲毒性等為測試終點的植物微核檢測方

16、法，是世界范圍內推廣運用的環(huán)境致突變性檢測技術。它具有許多其它方法無法比擬的優(yōu)點，比如蠶豆根尖微核技術在遺傳毒理檢測中具有良好的劑量效應和較寬的檢測物譜，以蠶豆為試驗材料成本很低，儀器較簡單，不傷害操作工作人員的健康，比較適合縣市級下的地方環(huán)境監(jiān)測部門使用。,六、結果與分析：,參考文獻[1]陳瑞嬌;李均祥. 蠶豆根尖微核試驗在環(huán)境致突變物檢測中的應用[J].韶關學院學報. 2006/27/9:87～90.[2] 王樊彥.蠶豆根尖

17、細胞馓棱技術現狀[j]，環(huán)境科學，1988．10(4)：66～70[3] 王英彥,湯大友.蠶豆根尖細胞微核檢測技術的污染指示性與其他指標的比較[J].中國環(huán)境科學,1987,7(5):45-50.[4] 段昌群等 重金屬對蠶豆的細胞遺傳學毒理作用和對蠶豆根尖微核技術的探討 [J]．植物學報 ，1995．37(1)：14～24[5]王英彥,湯大友.15種化學物質的蠶豆根尖細胞微核效應[J].中國環(huán)境科上升學,1986,6(2