重組dna藥物藥學(xué)專業(yè)

1、重組DNA藥物Recombinant DNA Drugs,三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 盛 德 喬shengdq@ctgu.edu.cnQQ:834309103,,重組DNA藥物：應(yīng)用重組DNA技術(shù)（包括基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)）制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療劑。重組基因的表達？,克隆基因的表達,表達載體的構(gòu)建 受體細胞的建立 表達產(chǎn)物的分離純化,,表達體系包括：表達載體原核表達載體真核表達載體宿主細胞大腸桿菌

2、、芽孢桿菌、鏈霉菌（原核）酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞（真核）,1. 原核表達體系 (E.coli 表達體系),標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志多接頭克隆位點強啟動子 翻譯調(diào)控序列 E.coli表達體系的不足：不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；很難表達大量可溶性蛋白。,大腸桿菌表達載體的結(jié)構(gòu),除了含有與克隆載體相同的元件之外，還必須

3、含有表達載體所需要的其它元件:啟動子是DNA鏈上能與RNA聚合酶結(jié)合并起始mRNA合成的序列大腸桿菌表達系統(tǒng)常用的啟動子有：lacZ啟動子 強啟動子,核糖體結(jié)合位點SD序列（Shine-Dalgarno sequence）--mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。SD序列與AUG之間的距離也會影響翻譯效率，一般以5～13個堿基為宜表達載體都含有相應(yīng)的SD序列及適當(dāng)長度的SD-ATG間隔距離,,終止子基因或操縱子3

4、′的一段核苷酸序列在表達載體中多放在多克隆位點的下游,表達載體,,,,常用的大腸桿菌表達載體,非融合蛋白表達載體表達的蛋白與天然狀態(tài)下存在的蛋白在結(jié)構(gòu)、功能、免疫原性方面基本一致。融合蛋白表達載體 融合蛋白（fusion protein）－表達的蛋白質(zhì)或多肽的N末端由原核DNA編碼，C末端由克隆的真核DNA編碼。,,這類載體SD-ATG間隔已固定，翻譯起始信號組織合理，其表達的蛋白在其N-端或C-端常融合有一段細菌的多

5、肽或蛋白質(zhì)。pGEX序列載體 （Pharmacia公司）GST系統(tǒng)b-半乳糖苷酶系統(tǒng)麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)蛋白A系統(tǒng) IgG-Sepharose,表達標(biāo)簽 tag,常用的標(biāo)簽有：GST-谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，glutathione-S-transferase）多肽 ，凝血酶（Thrombin）水解蛋白去掉GST標(biāo)簽 FLAG-DYKDDDDK，專門設(shè)計用于融合蛋白質(zhì)的免疫吸附純化 HA (influenza he

6、magglutinin epitope-YPYDVPDYA)流感血凝素抗原決定簇 His-C末端、N末端、或內(nèi)部帶有6×His標(biāo)簽(His-tagged)的融合蛋白 c-myc (EQKLISEEDL)方便蛋白的鑒定和純化！,GST 純化系統(tǒng),大腸桿菌表達系統(tǒng),優(yōu)點：遺傳背景清楚用大腸桿菌進行遺傳操作的方法非常完善生長繁殖周期短,表達中的問題,缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制，只能表達cDNA;缺乏翻譯后加工機制，不能折疊和

7、糖基化;融合蛋白形成包涵體（inclusion body），復(fù)性后才有活性;很難表達大量的可溶性蛋白。,為什么建立真核表達系統(tǒng)？,原核表達系統(tǒng)的缺陷：不能對表達的真核蛋白進行正確的折疊和翻譯后加工!!!哺乳動物細胞表達系統(tǒng),2. 真核表達體系,真核細胞：酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達的蛋白質(zhì) 表達產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點：操作技術(shù)難、費時,真核表達載體,真核

8、表達載體的功能元件原核DNA序列啟動子增強子剪接信號終止信號和加poly(A）信號篩選標(biāo)記新霉素抗性基因 neor 胸苷激酶基因tk,真核表達載體的種類,質(zhì)粒型載體pcDNA系列 Invitrogen公司產(chǎn)品pCMV-HA Clontech公司產(chǎn)品病毒型載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體昆蟲桿裝病毒載體,表達載體pcDNA4的物理圖譜,,轉(zhuǎn)染 —— 將表達載體導(dǎo)入真核細胞的過程方法

9、：磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 （Lipofectamine invitrogen 公司產(chǎn)品,實驗室常用） 顯微注射 轉(zhuǎn)染（病毒載體）,外源基因在真核細胞中的表達方式,依表達時間長短瞬時表達（一過性表達） 不整合穩(wěn)定表達 篩選表達方式分泌表達，非分泌表達融合表達，非融合表達,瞬間表達Transient expression :外源基因不整合到宿主染色體中，不能復(fù)制

10、，在細胞中的表達時間較短(2-3天)，轉(zhuǎn)染的方法相對簡單，耗時較少，適用快速分析.穩(wěn)定表達Stable expression :外源基因整合到宿主染色體,需要篩選，可獲得穩(wěn)定表達的細胞株，可復(fù)制，并可以穩(wěn)定傳代，耗時長，不易成功.,,哺乳動物細胞表達體系,CHO細胞表達系統(tǒng) ：CHO細胞表達系統(tǒng)能準(zhǔn)確進行轉(zhuǎn)錄后重組蛋白的加工修飾，表達的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性方面與天然蛋白十分接近。 CHO細胞屬于成纖維細胞，很少分泌自身的內(nèi)

11、源蛋白，而表達的外源產(chǎn)物是胞外分泌的，這樣便于產(chǎn)物的下游分離純化；在CHO細胞內(nèi)重組基因能高效擴增和表達；CHO細胞貼壁生長，且具有較高的耐受剪切和滲透壓能力，可以進行懸浮培養(yǎng)。幼倉鼠腎（BHK）細胞表達系統(tǒng),,哺乳動物細胞表達體系優(yōu)點：一是哺乳動物細胞能夠表達人或哺乳動物的蛋白質(zhì)；二是哺乳動物細胞可對表達的蛋白質(zhì)進行正確折疊、組裝和糖基化等加工，生產(chǎn)有生物活性的產(chǎn)品。,,真核基因表達應(yīng)注意的問題：載體必須是表達載體目的基因不

12、能有內(nèi)含子克隆過程中不能改變其ORF,,基因工程蛋白質(zhì)類藥物,細胞因子是指機體細胞合成和分泌的小分子多肽類因子，它們具有調(diào)節(jié)機體的生理功能和免疫功能，因而有可能利用基因工程技術(shù)進行生產(chǎn)，用于治療腫瘤、感染、免疫低下、造血功能障礙等疾病。目前已研制成功或正在研制的基因工程細胞因子類藥物主要有促紅細胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CF)、干擾素（IFN）、白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子、生長因子（GF）和凝血因子（

13、F）等。,基因工程細胞因子類藥物,基因重組人促紅細胞生成素（erythropoietin,EPO）,EPO是一種主要由腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位合成分泌的多功能糖蛋白激素, 是作用于紅系祖細胞的造血生長因子，對神經(jīng)元的許多功能也具有重要的調(diào)控作用。 EPO是最早發(fā)現(xiàn)并首先運用于臨床的造血生長因子， 1985年成功表達了重組人促紅細胞生成素(rhEPO)。rhEPO成為當(dāng)前研究開發(fā)最成功的基因工程藥物。,促細胞生成素的生物學(xué)作用,EPO

14、主要通過促進骨髓中紅系祖細胞的存活、增殖和分化以調(diào)控紅細胞的生成。促進系祖細胞的增殖、分化和成熟調(diào)控神經(jīng)元部分功能對細胞內(nèi)鈣濃度也有明顯的調(diào)節(jié)作用,人促紅細胞生成素基因重組,天然的 hEPO制品一般是從貧血病患者尿中提取的，所以藥源極為匱乏，不能滿足需要。因此，在20世紀(jì)80年代就開始rhEPO的研究，從胎兒肝中克隆出 hEPO基因, 并研制成功 rhEPO。1985年美國FDA 批準(zhǔn)rhEPO作為治療腎性貧血的藥物。研制rhE

15、PO的主要環(huán)節(jié)包括: 獲得人促紅細胞生成素基因和建立重組人促紅細胞生成素的有效表達系統(tǒng)等。,hEPO基因由5個外顯子（共582bp）和4個內(nèi)含子（共1562bp）組成。外顯子共編碼193個氨基酸，包括組成信號肽的27個氨基酸。經(jīng)人促紅細胞生成素cDNA的克隆及其核苷酸序列的測定。利用PCR技術(shù)擴增EPO基因：人胎肝中提取總mRNA →RT-PCR技術(shù)克隆hEPO基因。(cDNA)將cDNA插入真核表達載體，轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞表達。,

16、重組人促紅細胞生成素的表達系統(tǒng),為了獲得分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性與天然 EPO相似的rhEPO，選用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表達系統(tǒng)、非洲綠猴腎細胞COS7表達系統(tǒng)、幼倉鼠腎（BHK）細胞表達系統(tǒng)。目前國內(nèi)外首選CHO 細胞表達系統(tǒng)用來表達生產(chǎn)rhEPO。昆蟲細胞表達系統(tǒng)、乳腺表達系統(tǒng),促紅細胞生成素臨床應(yīng)用,腎功能衰竭所致的貧血：這種病只有靠連續(xù)輸血維持生命，但輸血又使病人面臨病毒感染和血過量的危險。EPO有刺

17、激紅細胞生成，免去慢性腎衰竭病人的輸血。癌性貧血：腫瘤引起的貧血或接受化療、放療所引起的貧血。 結(jié)締組織病貧血：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡所致的貧血。骨髓增生異常綜合征貧血：促進骨髓造血狀況改善。,基因工程肽類激素藥物,肽類激素是由內(nèi)分泌腺或內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)，經(jīng)血液循環(huán)，局部彌散到相應(yīng)的組織和細胞與受體特異結(jié)合發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，參與機體的生長、發(fā)育、生殖等多種生命活動過程。人生長激素、重組人胰島素、重組人降鈣素、重

18、組人胰高血糖素和重組人胰高血糖素樣肽-1,重組合成胰島素,胰島素與糖尿?。阂葝u素的發(fā)現(xiàn)對改變糖尿病患者的命運及揭示糖尿病的病因及相關(guān)影響因素意義重大。,胰島素的結(jié)構(gòu),人胰島素的一級結(jié)構(gòu)胰島素的兩個肽鏈分別為21個氨基酸組成的A鏈和30個氨基酸組成的B鏈，氨基酸排列有種屬差異。,胰島素的合成方法,方法一：分別合成A鏈和B鏈法 1 9 7 8 年，美國國立醫(yī)學(xué)中心的有關(guān)專家用基因重組法進行人胰島素的合成，即讓大腸桿菌分別產(chǎn)生

19、胰島素的A鏈和B鏈，再用化學(xué)方法將兩者連結(jié)起來。,方法二：通過合成人胰島素原的方法,即先合成人胰島素的前體，即胰島素原，再用酶切除C肽而制備人胰島素。,影響分離純化的主要因素產(chǎn)物活性、純度和雜質(zhì)產(chǎn)物表達形式和表達水平產(chǎn)物本身的分子特性產(chǎn)物的用途和需求量,基因工程藥物的分離純化,基因工程藥物的質(zhì)量控制,與傳統(tǒng)藥品生產(chǎn)的區(qū)別利用活細胞作為表達系統(tǒng)，產(chǎn)品為蛋白質(zhì)，具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)． 產(chǎn)品的制備過程中，藥物容易發(fā)生變化． 參與人

20、體的生理調(diào)節(jié)作用，極微量就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)，在性質(zhì)或劑量上不能有任何偏差．因此，必需要嚴格控制藥品質(zhì)量，確保產(chǎn)品安全有效。,分泌量極低而生理藥理活性極高具有細胞和組織特異性多數(shù)細胞因子具有多功能性細胞因子間存在復(fù)雜的相互作用具有低免疫原性,,基因工程藥物的特點,基因工程藥物的質(zhì)量要求,提供表達體系及工程菌的詳細資料。提供培養(yǎng)方法，純化方法、除去微量雜質(zhì)的方法等。要求進行理化鑒定，包括產(chǎn)品的特征、純度及與天然產(chǎn)品的一致性。要

21、求進行外源核酸和抗原檢測與天然產(chǎn)品進行生物活性或效力試驗的比較進行動物毒性試驗要有足夠的對人體的安全性資料必須經(jīng)過臨床試驗，以評價其安全性和有效性。,1)原材料的控制：　　　表達載體和宿主細胞　　　克隆基因的序列2)生產(chǎn)的控制：　　　原始細胞庫　　　有限代次的生產(chǎn)　　　連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)　　　分離純化,,,基因工程藥物的質(zhì)控要點,目的蛋白質(zhì)的含量測定,產(chǎn)物雜質(zhì)檢測,宿主細胞蛋白、病素和細菌等微生物、熱原質(zhì)、內(nèi)毒素、致敏原

22、及DNA等,,終產(chǎn)品的質(zhì)量控制,產(chǎn)品的鑒定：方法：電泳法、免疫學(xué)分析法、受體結(jié)合試驗和高效液相色譜法等內(nèi)容：氨基酸成分分析、肽圖分析、蛋白質(zhì)濃度及分子量測定、蛋白質(zhì)二硫鍵分析純度分析,生物活性測定：,安全性評價：,穩(wěn)定性考察：,產(chǎn)品一致性的保證：,體內(nèi)生物活性測定：根據(jù)目的基因產(chǎn)物的 生物學(xué)特性，建立適合的生物學(xué)模型體外生物活性測定：細胞培養(yǎng)計數(shù)法等,除一般安全性要求外，還要根據(jù)基因工程產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)特性，進行某些

23、藥物動力學(xué)和毒理學(xué)研究。,對純度、分子特征和生物學(xué)效價等多方面進行綜合評價,幾種常見基因重組藥物,重組人胰島素（rh-Insulin）本品是最早上市（1982年）的基因重組藥物。我國以大腸菌或酵母菌為工程菌的生產(chǎn)也已獲得成功。本品減少了動物胰島素的過敏反應(yīng)。重組人生長激素（rh-GH）促進長骨的軟骨生長區(qū)而增加長度，增加肌細胞數(shù)目和體積等作用而促進生長。,,重組人干擾素（rh-IFNs） 調(diào)節(jié)機體免疫防御功能，增加NK細胞、TC

24、細胞殺傷力；增強巨噬細胞吞噬活動；直接抑制及殺傷腫瘤細胞。具有抗病毒、抗腫瘤的效應(yīng)。重組人白細胞介素-2（rh-IL-2） 促進T細胞、NK細胞增殖，增強其殺傷活性；促進Β細胞增殖及分泌免疫球蛋白；促進巨噬細胞分泌TNF，增強其殺傷活性；誘導(dǎo)產(chǎn)生LAK及TIL細胞。用于腎癌、黑色素瘤、膀胱癌、結(jié)腸癌、肺癌以及非何杰金氏淋巴瘤、癌性胸腔積液等腫瘤疾病的治療。,,重組人腫瘤壞死因子（rh-TNF） 直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子，