第三章-醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)-人類基因組

1、第三章,人類基因組學(xué)Human Genomics,產(chǎn)生背景及概念,背 景　　1986年Dulbecco R等提出人類基因組計劃（HGP），隨著HGP的提出和實施，產(chǎn)生的基因組學(xué)。,概 念,以分子生物學(xué)技術(shù)、計算機技術(shù)和信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)為研究手段，以生物體內(nèi)全部基因為研究對象，在全基因背景下和整體水平上探索生命活動的內(nèi)在規(guī)律及其內(nèi)外環(huán)境影響機制的科學(xué)。,2001年2月中旬，《Nature》與《Science》分別發(fā)表了人類基因組工

2、作框架圖,報告人類基因組共有30 億個堿基對, 預(yù)測編碼基因31,000個,比最初預(yù)測的10 萬個編碼基因數(shù)大大減少。2003年人類基因組計劃宣布，人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn),第　一　節(jié)人類基因組和基因組學(xué),基因組(genome)是德國遺傳學(xué)家H. Winkler在1920年將gene（基因）和chromosome(染色體)兩個詞縮合而創(chuàng)造的一個新詞，意思是指染色體上的全部基因。幾十年來，隨著分

3、子生物學(xué)的發(fā)展，其含義擴展為在個體水平代表一個個體所有遺傳性狀的總和，在細胞水平代表一個細胞所有不同染色體（單倍體）的總和，在分子水平代表一個物種所有DNA分子的總和。,基因組學(xué)概念及范疇,基因組(genome),泛指一個有生命體、病毒或細胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。,基因組學(xué)(genomics),就是發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測序新技術(shù)以及計算機程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能的科

4、學(xué)。,,基因組學(xué)包括3個不同的亞領(lǐng)域結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics) 功能基因組學(xué)(functional genomics)比較基因組學(xué)(comparative genomics),基因組學(xué)概念,結(jié)構(gòu)基因組學(xué),結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics)是通過人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP) 的實施來完成的。HGP的內(nèi)容就是制作高分辨率的人類遺

5、傳圖和物理圖，最終完成人類和其它重要模式生物全部基因組DNA序列測定，因此HGP屬于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)范疇。,第　二　節(jié)人類基因組計劃,人類基因組計劃,HGP也稱人類基因測序計劃，主要目標是完成對人的基因組的所有堿基序列的測定，闡明人體中全部基因的位置、結(jié)構(gòu)、功能、表達、調(diào)控方式及致病突變的全部信息?；救蝿?wù)是完成遺傳圖、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。人類基因組包括 24條染色體，3×109bp，3-4萬個基因。,人類基因組計劃的

6、目標,人類基因組計劃是一項國際性的研究計劃。它的目標是通過以美國為主的全球性的國際合作，在大約15年的時間里完成人類24條染色體的基因組作圖和DNA全長序列分析，進行基因的鑒定和功能分析。人類基因組計劃的“科學(xué)產(chǎn)品”將是一個人類遺傳信息數(shù)據(jù)庫，將是一本指導(dǎo)人類進化的“說明書”。 人類基因組計劃的最終目標就是確定人類基因組所攜帶的全部遺傳信息，并確定、闡明和記錄組成的人類基因組的全部DNA序列。,人類基因組計劃的研究概況 1

7、986年,1988年美國能源部和國家衛(wèi)生研究院率先在美國開展人類基因組計劃，并經(jīng)國會批準由政府給予資助。此后，成立了一個國際間的合作機構(gòu)——人類基因組織 (Human Genome Organization)，由多個國家籌集資金和科研力量，積極參加這一國際性研究計劃。,人類基因組計劃的研究概況 1988年,1989年，美國國立衛(wèi)生研究院成立了人類染色體研究中心，沃森出任第一任主任。,人類基因組計劃的研究概況 1989年,1990

8、年，美國國會批準了“人類基因組計劃”，并于10月1日正式啟動，由多國科學(xué)家參加、被稱為“生命科學(xué)阿波羅計劃”的人類基因組計劃正式啟動。預(yù)計用15年時間，投資30億美元，完成 30 億對堿基的測序，并對所有基因進行繪圖和排序。美國承擔了全部任務(wù)的54%，英國33%，日本7%，法國2.8%，德國2.2%。中國于1999年9月加入人類基因組計劃并承擔了 1% 的測序任務(wù)。,人類基因組計劃的研究概況 1990年,1998年，生產(chǎn)DNA測序

9、儀的最大廠家Perkin-Elmer(簡稱PE)公司與文特爾領(lǐng)導(dǎo)的基因研究所合作成立了塞萊拉（Celera）遺傳信息公司，并宣布他們將利用最新技術(shù)在3年內(nèi)完成人類基因組的測序工作，這使得該計劃處于一種公私競爭的狀態(tài)，從而加快了人類基因組的研究步伐。,人類基因組計劃的研究概況 1998年,2000年6月26日，美國國家人類基因組研究所所長弗朗西斯·柯林斯、塞萊拉公司的董事長兼首席科學(xué)家克萊格·文特爾、美國總統(tǒng)克林頓

10、、英國首相布萊爾聯(lián)合宣布人類基因組工作草圖繪制成功。此后，人類基因組研究進入繪制“完成圖”的階段。與“框架圖”相比， “完成圖”的覆蓋率從90％擴展到100％，準確率從99％上升到99.99％。,人類基因組計劃的研究概況 2000年,2001年2月12日，參加繪制人類基因組圖譜的美、英、日、法、德、中6國科學(xué)家公布了更加準確、清晰、完整的人類基因組圖譜，并指出人類基因總數(shù)只有 3 ~ 3.5萬個, 編碼序列占2%。 2001年7

11、月10日，中國“人類基因組計劃”重大項目秘書長楊煥明教授宣布：在人類基因組完成圖的繪制工作中，中國已率先超額（1.13%）完成所承擔的任務(wù)。,人類基因組計劃的研究概況 2001年,（一）遺傳圖 （二）物理圖 （三）序列圖 （四）基因圖,HGP包括以下研究內(nèi)容,100-200 kb克隆片段,基因組測序的一般流程,分級鳥槍測序法,基因組DNA,細菌人工染色體文庫,DNA克隆的排序

12、 （物理作圖）,分段測序,隨機打斷后克隆,DNA測序,DNA序列的組裝,一、 遺傳圖譜（連鎖圖譜）,概念：指基因或分子標記在染色體上的相對位置與遺傳距離，用厘摩（cM）表示。1cM的遺傳距離表示在100個配子中有1個重組子。在哺乳動物中，遺傳圖譜上1cM的距離大約相當于物理圖譜上1,000,000bp。人類基因組的全長約3600cM,遺傳圖是將每條染色體上的基因或遺傳標記的相對位置經(jīng)連鎖分析確定下來，構(gòu)成圖譜，因

13、此，需借助相應(yīng)的遺傳標記。 DNA技術(shù)的建立為人類提供了大量新的遺傳標記。 遺傳標記有三代,第一代DNA遺傳標記是RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）。DNA序列上的微小變化，甚至1個核苷酸的變化，也能引起限制性內(nèi)切酶切點的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長度的變化。,第二代DNA遺傳標記利用了存在于人類基因組中的大量重復(fù)序列：重復(fù)單位長度在15-65個核苷酸左右的小衛(wèi)星DNA；重復(fù)單位長度在2-6個核苷酸之間的微衛(wèi)星DNA，又稱為簡短

14、串聯(lián)重復(fù)（STR、STRP或SSLP）。,第二代DNA遺傳標記STRP的優(yōu)點是“多態(tài)性”與“高頻率”。由于(A)n，(CA)n，(CGG)n等短重復(fù)序列在進化上不受選擇，在同一位點上可重復(fù)單位數(shù)量變化很大，配對時又容易產(chǎn)生“錯配”，使這樣的位點遍布于整個基因組。已有5264個STRP為主體的遺傳標記“連鎖圖”，平均分辨率已達600kb，其中第17號染色體上平均每495 kb有一個標記，第9號染色體上平均每767 kb有一個標記，整個

15、基因組中只有三處標記間距大于4Mb。,第三代DNA遺傳標記，可能也是最好的遺傳標記，是分散于基因組中的單個堿基的差異，即單核苷酸的多態(tài)性（SNP），包括單個堿基的缺失、插入和替換。SNP中大多數(shù)為轉(zhuǎn)換，即由一種嘧啶堿基替換另一種嘧啶堿基，或由一種嘌呤堿基替換另一種嘌呤堿基，顛換與轉(zhuǎn)換之比為1：2。SNP有可能在密度上達到人類基因組“多態(tài)”位點數(shù)目的極限。估計人類基因組中可能有300萬個SNP位點！SNP與RFLP和STRP標記的主

16、要不同之處在于，它不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記。,遺傳圖譜繪制的意義“遺傳圖”的建立為人類疾病相關(guān)基因的分離克隆奠定了基礎(chǔ)。擁有5000多個遺傳學(xué)位點，相當于把整個人類基因組劃分為5000多個小區(qū)，并分別設(shè)置了“標牌”。如果在家系中證實該基因與某個標記不連鎖（重組率為50%），表明該基因不在這一標記附近。如果發(fā)現(xiàn)該基因與某個標記有一定程度的“連鎖”（重組率小于50%但大于0），表明它可能位于這個標

17、記附近。如果該基因與某標記間不發(fā)生重組（重組率等于0），我們就推測該標記與所研究的疾病基因可能非常接近。,人類基因組的物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標簽位點，STS）為“路標”，以堿基對（bp，kb，Mb）作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。STS是基因組中任何單拷貝的長度在100～500bp之間的DNA序列，與核酸內(nèi)切酶識別序列相關(guān)聯(lián)。物理圖主要內(nèi)容是建立相互重疊連接的“相連DNA片段群”。,物 理 圖,序 列 圖

18、人類基因組的核苷酸序列圖是分子水平上最高層次、最詳盡的物理圖。測定總長約1米、由30億個核苷酸組成的全序列是人類基因組計劃的最終目標。人類所擁有的基因位點都是相同的，不同種族、不同個體的基因差異(人類基因組的多樣性)以及“正?！迸c“疾病”基因的差異，只是同一位點上的等位基因的差異。人類基因組計劃所提供的人類核酸序列圖，蘊藏了決定我們生、老、病、死的所有遺傳信息，將成為人類認識自我、改造自我－使人類健康長壽的知識源泉，為21世紀現(xiàn)代

19、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)奠定了基礎(chǔ)。,在識別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。 在人類基因組中鑒別出占具2%－5%長度的全部基因的位置、結(jié)構(gòu)與功能，最主要的方法是通過基因的表達產(chǎn)物mRNA反追到染色體的位置。,基 因 圖,基 因 圖 CpG島的應(yīng)用,CpG島(CpG island)：描述哺乳動物基因組DNA中的一部分序列，其特點是C和G的總和超過4種堿基總和的50%，即每10個核苷酸約出

20、現(xiàn)一次雙核苷酸序列CG。具有這種特點的序列僅占基因組DNA總量的10%左右。 從已知的DNA序列統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的管家基因(House-Keeping gene)及約占40%的組織特異性基因的5‘末端含有CpG島，其序列可能包括基因轉(zhuǎn)錄的啟動子及第一個外顯子。因此，在大規(guī)模DNA測序計劃中，每發(fā)現(xiàn)一個CpG島，則預(yù)示可能在此存在基因。,基 因 圖 計算機應(yīng)用及cDNA策略,計算機應(yīng)用：通過軟件進行預(yù)測（生物信息學(xué)）cDNA策略

21、：把特定組織中的mRNA分離出來，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA片段，建立EST位標，根據(jù)轉(zhuǎn)錄順序的位置和距離繪制的圖譜。 是染色體DNA某一區(qū)域內(nèi)所有可轉(zhuǎn)錄序列的分布圖，是基因圖的雛形。,,第三節(jié) 后基因組時代( Postgenome era),* 人類基因組計劃完成之后，生物學(xué)被重新劃分為前基因組和后基因組兩部分。* 科學(xué)研究已開始進入“后基因組時代”。主要是開展蛋白質(zhì)組的研究。* 有科學(xué)家形象地說道：即使基因測序全

22、部完成，也只好像是一本沒有姓名、只有號碼的電話簿。“后基因組時代”的最終目標，是要把深奧的DNA語言變成一本基因大百科全書。,人類基因組工程(human genome projects)的含義,盡管工程規(guī)模和要處理的信息量都很大，但其技術(shù)難度似乎不好與阿波羅計劃和邁哈頓計劃相比。是人類了解生命現(xiàn)象過程中的重要一步，但它所能夠回答的問題是有限的！它不會立刻使我們的壽命延長。不會使我們立刻知道人類疾病的發(fā)病機理和治療方法。不會告訴我

23、們思維過程和個體發(fā)育的機制。不會告訴我們地球上的生命究竟是怎樣產(chǎn)生的。,人類基因組序列測完后（“后基因組時代”）的工作,分析所有的這些基因及其編碼產(chǎn)物（主要是蛋白質(zhì)）是如何單獨和共同在生命過程中發(fā)揮作用的 。在目前階段研究蛋白比研究基因難得多，而成千上萬的結(jié)構(gòu)和功能都復(fù)雜多樣的蛋白分子才是生命過程的最后執(zhí)行者。我們現(xiàn)在還沒有有效的研究手段去揭示蛋白分子在生物體內(nèi)究竟完成什么功能、又是通過何種機制去完成其生物功能的等等。,一、基因組

24、多樣性計劃,不同人種、不同民族基因組的異同關(guān)系。探討人類進化和種族演化的歷史。個體化用藥。疾病易感性。,二、功能基因組學(xué),完成一個生物體全部基因組測序后即進入后基因組測序階段——詳盡分析序列，描述基因組所有基因的功能，包括研究基因的表達及其調(diào)控模式，這就是功能基因組學(xué)（functional genomics）。,（一）鑒定DNA序列中的基因（二）同源搜索設(shè)計基因功能 （三）實驗性設(shè)計基因功能 （四）描述基因表達模式,功能基因

25、組學(xué)的主要具體內(nèi)容包括以下方面,功能基因組學(xué)研究策略及主要內(nèi)容,三、比較基因組學(xué),比較基因組學(xué)(comparative genomics)涉及比較不同物種的整個基因組，是利用生物在進化上的親緣關(guān)系，來比較它們與人類之間的相似與相異，以便深入理解每個基因組的功能和進化關(guān)系。,四、環(huán)境基因組學(xué)與環(huán)境因素相關(guān)的疾病遺傳易感性基因,五、疾病基因組學(xué) 分離、分析疾病的致病基因和相關(guān)基因，并研究其致病機制,六、藥物基因組學(xué)

26、 研究包括藥物在內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)引起機體反應(yīng)上的遺傳差異,以生物大分子為研究對象，以計算機為工具，運用數(shù)學(xué)和信息科學(xué)的觀點、理論和方法去研究生命現(xiàn)象、組織和分析呈指數(shù)級增長的生物信息數(shù)據(jù)的一門科學(xué).,七、生物信息學(xué),http://www.ebi.ac.uk/embl/,http://www.ddbj.nig.ac.jp/。,http://www.ncbi.nlm.nih.gov,第四節(jié) 基因定位與克隆,人類基因組計劃的完成，最重要的后續(xù)

27、工作是運用一定的方法，將各個基因確定到染色體的實際位置。基因定位對提高人類對疾病產(chǎn)生的病因?qū)W的認識有重要意義。,1.連鎖分析（Linkage analysis）,基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標記相連鎖的特點進行定位。,基因定位的方法,重組值（recombination fraction） 是基因定位時兩個基因間遺傳圖距的量度，

28、即基因間的遺傳距離。如果兩個基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）遺傳標記（genetic marker） 用連鎖分析發(fā)法進行基因定位需要已知的記憶內(nèi)作為遺傳標記，這些標記按孟德爾方式遺傳，標記位點應(yīng)是多態(tài)的。,基因定位的方法,常用的連鎖分析方法為家系連鎖分析法采用對數(shù)優(yōu)勢記分法(Logoddsscore，LOD)數(shù)學(xué)模式,數(shù)學(xué)原理： 在獲得兩個基因位點的某上份系譜分析數(shù)據(jù)后

29、，將假定這兩個位點以某一重組值連鎖的似然性，與假定這兩個位點不連鎖的似然性相對較，從二者比值的對數(shù)值域，判斷支持和反對連鎖的優(yōu)勢。,L(0.5)表示重組值為50%，即完全不連鎖的似然性。Z≥3時可確定連鎖，Z≤-2時可否定連鎖，-2<Z<3時，須做進一步分析,基因定位的方法,2、體細胞雜交法基因定位：體細胞：即生物體除生殖細胞外的任一細胞。體細胞雜交的概念： 也稱細胞融合（cell infusion），是將來

30、源不同的兩種細胞融合成一個新細胞。新產(chǎn)生的細胞稱雜種細胞（hybrid cell），含雙親不同的染色體。,對象： 人的細胞 鼠類：大鼠、小鼠、倉鼠 雜種細胞的特點： 在繁殖傳代過程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或一條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來。,,原理： 細胞進行融合時，培養(yǎng)液中只有部分細胞融合成雜種細胞，還有大量未融合的雙親細胞。這就需要選擇分離純化雜種細胞。為此要創(chuàng)造

31、一種只讓雜種細胞生長繁殖而親本細胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細胞和親本細胞對生長條件的要求和代謝的差異來進行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。,HAT選擇系統(tǒng),人的突變細胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠細胞株：缺乏TK酶 兩者融合培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中H 為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）A 為氨基蝶呤，可阻斷正常的DNA合成(嘌呤及TMP合成受抑制)T 為胸腺嘧啶脫氧核苷，在胸

32、苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料,鼠細胞： 由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黃嘌呤合成腺嘌呤，鳥嘌呤，但由于無TK，無法合成胸腺嘧啶。(嘧啶合成障礙)雜種細胞： 有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶(嘌呤和嘧啶都可以正常合成),人細胞：①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受阻 。②同時由于HGPRT的缺乏，無法利用次黃嘌呤

33、通過旁路合成DNA(嘌呤合成障礙),因此在HAT培養(yǎng)基上，,將篩選出來的雜種細胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫學(xué)特性，Miller等運用體細胞雜交并結(jié)合雜種細胞的特征，證明雜種細胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17號染色體的雜種細胞都因有TK活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK基因定位于17號染色體上，這是首例應(yīng)用體細胞雜交法進行的基因定位。,3.原位雜交和熒光原位雜交,原位雜交（in situ h

34、ybridization） 是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學(xué)技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，胰島素基因用此方法定位于11p15。原理 堿基的互補配對，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標記的DNA、RNA或與mRNA互補的cDNA作探針，可檢測細胞基因組中的同源部分。,,原位雜交的特點 雜交在載玻片上的中期染色體上進行，而不是在溶液和膜上進行。所

35、謂原位是指在標本上DNA原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標記的已知核酸探針雜交，通過放射自顯影來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強度來確定探針的位置，從而準確地進行基因定位。,原位雜交的步驟,制備中期染色體 DNA原位變性 變性 放射性或非放射性標記探針

36、 雜交（在載玻片上） 洗膜 放射性標記：放射自顯影 檢測 非放射性標記：熒光染料與抗體或蛋白結(jié)合 記錄雜交信號 結(jié)合染色體形態(tài)進行基因定位,,,,,,,,,熒光原位雜交（florescence in sit

37、u hybridization，F(xiàn)ISH）,用特殊熒光素（dig或Biotin）標記探針DNA（Nick translation 標記法），變性成單鏈后與變性后的染色體或細胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。FISH優(yōu)點：可用來作基因或特定DNA片段的染色體區(qū) 域定位。缺點：必須在已知探針的情況下方可進行。,單色FISH,多色FISH,放射雜種,是用射線輻射人體細胞染色體，使其隨機片段化，再與鼠細胞融合，形

38、成人/鼠細胞放射雜種，人的隨機染色體片段，整合入鼠細胞染色體中。構(gòu)建放射雜種細胞系克隆嵌板，可用于基因定位。,二、基因克隆 致病基因克隆有兩種基本策略 功能克隆 定位克隆1 功能克隆(functional cloning) 是利用疾病已知的遺傳損傷而引起的生化功能如蛋白質(zhì)氨基酸缺陷的信息,進行基因定位,進而克隆該基因,2 定位克隆(positional cloning)

39、 是先進行基因定位作圖,然后找到來自該定位區(qū)的基因并進行克隆,在此之后才能明確該基因的功能.功能克隆和定位克隆的比較 在傳統(tǒng)的功能克隆中,基因功能的研究先于基因鑒定.在定位克隆中,基因定位在先,最后再鑒定基因.基因已鑒定后,可以進行基因功能的選擇性研究.,3 候選克隆,候選克隆策略是在已定位和已克隆的基因越來越多的背景下，形成的一種新的基因克隆途徑。 分為： 定位候選克隆 功能候選克隆