菌種保存、傳代、使用、銷毀管理規(guī)程,操作規(guī)程

1、1菌種管理制度菌種管理制度1、目的建立菌種保存、傳代、使用、銷毀標準操作規(guī)程，規(guī)范微生物學檢定用菌種的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學檢驗結果的準確可靠。2、適用范圍本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的購買、保存、傳代、使用及銷毀等。3、定義?標準菌株是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。?傳代用菌種是指用標準菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代

2、及制備工作用菌種。?工作用菌種是指用標準菌株或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。?菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。4、職責4.1部門主管負責菌種的申購、接收、保存分發(fā)。4.2微生物檢驗員負責菌種的確認、傳代、使用及銷毀。5、規(guī)程5.1菌種的申購部門主管根據菌種的使用情況，提出年度購買計劃（包括臨時檢驗需要），填寫申購流程，經審批后，

3、向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校┧帣z所購買凍干菌種（標準菌株）或傳代用菌種，購買時，需確定菌種的代數，以便控制傳代代數。5.2菌種的接收菌種到達實驗室后，由部門主管接收菌種，檢查其名稱和數量，以及每一支的完整性，同時將菌種的所有信息，填寫在《標準菌株庫存記錄》上，內容包括：名稱、數量、編號（無編號者按檢定菌種的編號原則編號）、代數、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯存于4～8℃冰箱中，在一周內必須完成轉種。5.3菌種的保存5.3.1工作

4、用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉移至4～8℃冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應隨時檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現異常情況，經應滅活處理后銷毀。保存時間根據菌種種類35.4.1.1.1物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.2培養(yǎng)基?改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：用于黑曲霉復蘇、復壯；?液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：用于生孢梭菌復蘇、復

5、壯；?營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復蘇、復壯；?改良馬丁培養(yǎng)基：用于白色念珠菌復蘇、復壯5.4.1.1.3標準菌株的復蘇操作步驟：以下操作均在生物安全柜內進行。a)在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風干。b)用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時必須小心，因為安瓿遇熱時可能會破裂）。c)以無菌方法用一無菌吸管從已準備好的上述液體

6、培養(yǎng)基中移取0.5～0.8ml到安瓿中。d)輕輕地旋轉安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。e)用無菌吸管將安瓿內菌液全部轉接到相應的液體培養(yǎng)基。f)根據安瓿上所標明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應的溫度（細菌培養(yǎng)溫度30～35℃，培養(yǎng)18～24小時；真菌培養(yǎng)溫度23～28℃，培養(yǎng)3～5天。觀察是否渾濁，渾濁說明菌種復蘇生長；若不渾濁，細菌應延長培養(yǎng)時間至7天，真菌應延長培養(yǎng)時間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。g)若黑曲霉為菌懸

7、液，則先放置室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內液體1～2滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置23～28℃培養(yǎng)5～7天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜色，斜面?zhèn)让鏌o色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認后用含有0.05%（mlml）的吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。h)取經復蘇后的上述細菌菌液810ml至液體培養(yǎng)基中按f）項操作對菌種進行復壯。以無菌技術向復壯后的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻，

8、1~2ml管，分裝于凍存管。每個菌種制備10支，按順序進行編號，最后一支做為質控管進行質量控制，即進行相應的確認，其余作為儲備管在30℃冷凍條件下保存。黑曲霉按g）項下方法進行復壯，制成復壯后的孢子懸液20ml。以無菌技術向復壯后的菌種菌懸液中1~2ml管加石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，封存于凍存管，置于20℃冷凍或2～8℃冰箱中保存。制備10支，按順序進行編號，最后一支做為質控管進行質量控制，即進行相應的確認