血漿中藥物分析實驗第一部分

1、生物樣品中藥物分析,,,一、生物樣品中藥物分析的性質和意義二、生物樣品中藥物分析的對象和特點三、生物樣品的種類四、生物樣品分離、純化與濃集,,一、生物樣品中藥物分析的性質和意義（一）生物樣品中藥物分析的性質（二）生物樣品中藥物分析的意義,（一）生物樣品中藥物分析的性質,生物樣品藥物分析，又稱體液藥物分析、生物藥物分析，是隨著臨床藥學、臨床藥理學的發(fā)展和需要而建立起來的一門新興學科。,,生物樣品藥物分析，旨在通過各種分析手段，了

2、解藥物在生物樣品內的數(shù)量和質量變化。獲得藥物代謝動力學的各種參數(shù)、藥物在生物樣品內的生物轉化、代謝的方式和途徑等信息。從而為藥品生產、臨床醫(yī)療、實驗研究等方面對研究中的藥物作出估計與評價，對藥物的改進與發(fā)展作出貢獻。,（二）生物樣品中藥物分析的意義,1.新藥評價和新藥開發(fā)中的意義大量事實證明，如無臨床藥理學和臨床藥學研究給新藥以確切的評價，要做到臨床安全、合理、有效地用藥將會遇到許多困難。因此，加強藥物在生物樣品內作用機理的研究

3、，以了解和闡明藥物結構、理化性質、劑型及生產工藝與藥物療效等關系，已成為評價藥品質量的重要內容和依據。,2.在臨床合理用藥中的意義影響血藥濃度的因素很多，同一種給藥方案難以對每一個病人都達到理想的治療效果。為達到用藥安全、合理、有效，必須設計個體化給藥方案，就需要做好對治療藥物監(jiān)測，以血藥濃度為指標，達到個體化用藥。,課堂活動,《地高辛血藥濃度監(jiān)測２３３例結果分析》請閱讀該文獻后，回答下列問題（以小組為單位，上交討論結果）：為什

4、么要進行地高辛血藥濃度監(jiān)測？影響地高辛療效的因素有哪些？,,一、生物樣品中藥物分析的性質和意義二、生物樣品中藥物分析的對象和特點三、生物樣品的種類四、生物樣品分離、純化與濃集,,二、生物樣品中藥物分析的對象和特點（一）生物樣品中藥物分析的對象（二）生物樣品中藥物分析的特點,（一）生物樣品中藥物分析的對象,凡是生物樣品內藥物到達之處，如體液、器官、組織、排泄物等都是分析的對象。所以生物樣品內藥物分析的樣本有血液、尿液、唾液、

5、膽汁、淋巴液、淚液、脊髓液、汗液、乳汁、各種器官以及呼出的氣體等。,,生物樣品內藥物分析的目標，不僅是母體藥物也包括代謝產物。因為代謝產物常具有生理活性，弄清它們的種類、結構、數(shù)量及分布情況，可了解藥物在生物體內的變化及消除規(guī)律，這對安全用藥和正確評價藥物質量也是非常重要的。,,由于新藥進入臨床試驗之前，或者對已上市藥在某一方面的重新評價，一般要求先在動物體上進行實驗，所以生物樣品內藥物分析對象不僅是人體，也包括動物體。,（二）生物樣

6、品中藥物分析的特點,與常規(guī)藥物分析相比，生物樣品內藥物分析在靈敏度和選擇性等方面有較高的要求。微量藥物存在于大量生物介質中，樣品中含內源性干擾雜質，這些干擾物質又隨疾病情況不同而有所不同。,,很多藥物在生物樣品內經過代謝可產生一種或多種代謝物，母體藥物和代謝物又能同生物大分子結合。這一切給藥物分離、分析帶來困難，這就要求分析方法具有更高的選擇性。,,另外，在生物樣品中，藥物濃度都很低，一般血藥濃度在10-6-10-9g/ml之間。

7、且生物樣品若為血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法要有較高的靈敏度。,,一、生物樣品中藥物分析的性質和意義二、生物樣品中藥物分析的對象和特點三、生物樣品的種類四、生物樣品分離、純化與濃集,血液(血漿、血清)：體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關系——最常用的生物樣品。,,血液（blood）血液中藥物濃度可以較好地體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關系。是最為常用的生物樣品。分為全血、血漿和血清。,全血、血漿和血清的區(qū)別,全血：血

8、液經抗凝處理后的全部血液。血漿：離心除去血細胞后所得到的淡黃色液體。血清：如血液不經抗凝處理，讓其自行凝固，則在抽血后的一段時間內，血液會自動在一系列凝血因子的作用下發(fā)生凝集，血液首先凝固成一個整體，再經過一段時間或用離心機離心，血液中凝固的部分會與一些清澈淡黃色的液體分離開，這些液體稱為血清。,血漿和血清的區(qū)別,血清與血漿從表面上看似乎沒有什么不同，但其內在的主要區(qū)別是血清中不含纖維蛋白原，是未經抗凝處理過的血液凝固后得到的。,,

9、1. 血樣的采集：一般用注射器直接采集靜脈血，每次1~5ml；動物實驗時，采血量不宜超過動物總血量的十分之一。,,,,,,2. 血樣的制備測定血中藥物的濃度，通常是指測定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血。,,血漿的制備采集的靜脈血液置含有抗凝劑的試管中，混合后，以2500~3000r/min離心5~10min使與血細胞分離，所得淡黃色上清液即為血漿（ plasma ） 。抗凝劑—最常用的是肝素（heparin）

10、。其它抗凝劑EDTA、枸櫞酸鹽、草酸鹽等。,,3.血樣的應用：藥物動力學生物利用度臨床治療藥物濃度監(jiān)測,,尿液—用于藥物劑量回收、尿清除率、生物 利用度、內源性活性物質、藥物代謝分型及代謝物等的研究測定。,毛發(fā)—用于藥物濫用監(jiān)測及微量元素測定。肝、胃、腎、肺、腦等臟器組織—動物試驗研究藥物吸收、分布狀態(tài)及服藥過量中毒死亡。,生物樣品的貯存與處理,冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1-2d) 冷凍—冷柜(-20℃)或低

11、溫冷柜(-80℃)，中長期保存。冷藏或冷凍時限經穩(wěn)定性考察后確定。,,血樣的貯存：采集后及時分離血漿和血清（≤2h），分離后再貯存若不予先分離，血凝后冰凍保存，則因冰凍有時易引起細胞溶解，會阻礙血漿或血清的分離。,,注意事項：冷凍的樣品測定時，需臨時解凍。解凍后的樣品應一次性測定完畢，不應反復凍融。如果采集的樣品不能一次性測定，則應以小體積分裝貯存，每次按計劃取一定數(shù)量進行測定。,,一、生物樣品中藥物分析的性質和意義二、生

12、物樣品中藥物分析的對象和特點三、生物樣品的種類四、生物樣品分離、純化與濃集,,生物樣品的預處理技術：分離、純化、富集或化學衍生化等，目的是為藥物的最終測定創(chuàng)造良好的條件。分離——消除內源性物質、代謝物或其它共存藥物的干擾純化與濃集——提高被測藥物的靈敏度樣品經分離、純化與濃集與測定方法相結合，達到專屬性強、靈敏度高、準確性好。,,樣品的預處理是體內藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié)。也是分析中最困難、最繁雜的工作。對于生物樣品的

13、預處理很難規(guī)定固定的程序和方式，必須結合測定實際和要求，采取恰當?shù)姆椒ê图夹g。,（一）生物樣品預處理的目的,①使藥物從綴合物及結合物中釋放測定藥物的總濃度②使樣品純化消除生物基質中內源性物質的干擾③提高檢測靈敏度適應和符合測定方法要求的靈敏度④防止分析儀器的污染提高分析儀器的耐受程度、改善分析結果,①使藥物從綴合物及結合物中釋放,藥物在體內存在形式：游離型藥物 代謝物 藥物或代謝物與蛋白結合物 預處理：藥物或代謝

14、物從“結合物”或綴合物中釋放，測定藥物或代謝物的總濃度。,②樣品純化,生物樣品的基質——組成復雜、干擾多例如：血清：含有高分子的蛋白質和低分子的糖、脂肪、尿素等有機物，也含有Na+、K+、Cl-等無機物。尿液：含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、Na+、K+、Cl-等。藥物組分：藥物含量低，一般為“微克”或“納克”水平，經預處理使藥物純化、富集，以利于進一步檢測。,③提高檢測靈敏度,預處理—降低背景噪音—提高靈敏度特異性強、靈

15、敏度高的分析方法預處理相對簡單 不具備分離功能的方法(光譜法)預處理十分重要,④防止分析儀器的污染,生物樣品基質中脂肪、蛋白質、不溶性顆粒會污染分析儀器。因此，應根據分析儀器的耐受程度，選擇恰當?shù)念A處理方法。,,舉 例應用高效液相色譜法檢測血藥濃度，進行樣品預處理的作用。,,去除血漿（或血清）中的蛋白質延長色譜柱的壽命（去除固體雜質）改善選擇性（排除生物基質的干擾）改善組分可測性（被測組分的富集）改善組分色譜行為

16、（化學衍生化）,生物樣品的預處理方法,有機破壞法去除蛋白質法溶劑萃取法綴合物的水解法化學衍生化法,去除蛋白質法,可使結合型藥物釋放去除蛋白后取上清液直接分析測定去除蛋白后取上清液經進一步分離、純化、濃集后分析測定。,去除蛋白質的方法,1.加入與水混溶的有機溶劑—蛋白質脫水沉淀2.加入中性鹽—“鹽析”沉淀蛋白質3.加入強酸—與蛋白質陽離子(銨基) 形成不溶性鹽沉淀,去除蛋白質的方法,4. 加入重金屬鹽—與蛋白質陰離子

17、 (羧基)形成不溶性鹽沉淀5. 超濾法—半透膜濾除可溶性生物大 分子物質(蛋白質)6. 酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白質7. 加熱法—蛋白質變性凝固,舉例：常用的去除蛋白質的方法,加入與水相混溶的有機溶劑常用有機溶劑:乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃。血樣與溶劑體積比—1：（ 1~3 ） ，可除去90%以上蛋白質。高速離心分離（12000r/min ）—離心1~2min，可以將析出的蛋白質完全沉淀。注意：普通離心機（3

18、000r/min）不能將蛋白質沉淀完全。,液—液萃取法,原理：大多數(shù)藥物為脂溶性，在有機溶劑中溶解度大于水中溶解度。大多數(shù)內源性雜質是強極性的水溶性物質。,,溶劑選擇—合適的溶劑是成功的主要條件了解藥物與溶劑的化學結構及其性質—相似相溶的原則沸點低、易揮散，毒性小與水不相混溶不影響進一步檢測具有較高的化學穩(wěn)定性和惰性,固相萃取法,優(yōu)點：引入雜質少完全避免乳化的形成在優(yōu)化條件下有較高的萃取率，重現(xiàn)性也較好可以用較少量的