與順式肽鍵單元相關的甘氨酰胺及其衍生物的質子轉移機制及相關性質研究.pdf

1、隨著X-ray和NMR等實驗手段分辨率的提高，含順式肽鍵單元的蛋白質數目也隨之增加。作為一種反常的存在形式，順式肽鍵單元的出現總是具有功能或結構上的特定意義，但對其存在形式和穩(wěn)定性尚無明確的認識。此外，低壘氫鍵在酶催化中的存在性及其意義也是人們目前爭論的焦點問題之一。鑒于此，本論文就重點圍繞順式肽鍵和低壘氫鍵的相關問題，利用密度泛函方法(DFT)，系統(tǒng)考察了順式肽鍵單元模型化合物一一甘氨酰胺及其衍生物的相關性質和低壘氫鍵在絲氨酸蛋白酶催

2、化進程中的存在性及其意義，并取得了一些有意義的研究成果，具體如下： (1)首先，我們系統(tǒng)地考察了甘氨酰胺在氣相和液相中的構象行為。結果表明：在氣相中，存在七種穩(wěn)定的構象，分別對應于三對鏡像異構體和一個具有Cs平面對稱性的構象(分別記作構象Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，其中的鏡像異構體可以進一步通過圓二色光譜(VCD)得到證實。通過與相關實驗和理論數據的比較，澄清了各種構象之間的相對穩(wěn)定性，確認了甘氨酰胺的最穩(wěn)定構象，一的基準。進而探討了其相

3、關的光譜性質，從而為后續(xù)研究其相關性質建立了一個統(tǒng)如紅外光譜、拉曼光譜和核磁共振等光譜，為實驗上各種構象的檢測和光譜指認提供了理論依據。在溶液中，各種構象的相對穩(wěn)定性由氣相中的Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ變?yōu)棰?Ⅱ>Ⅳ>Ⅲ，其中構象Ⅰ仍為最穩(wěn)定構象。相對于氣相結構，除構象Ⅱ中的二面角發(fā)生較大變化以外，其余構象的結構參數變化不大。在紅外光譜特征上，主要表現為紅外吸收強度的增加和特征譜羰基振動頻率的明顯紅移。 (2)鑒于甘氨酰胺相關性質的缺乏，在

4、上述氣相構象的基礎上，我們進一步系統(tǒng)考察了其酸堿性和氧化還原性。結果表明，在氣相中，甘氨酰胺中三個堿性位點的相對活性為：氨基N>羰基O>酰胺N；三個酸性位點的相對活性為：酰胺N>烴基C>氨基N。因此，甘氨酰胺在氣相中主要表現為氨基N堿和酰胺N酸。與去質子化相比，在氣相中，甘氨酰胺更容易表現為以烴基C原子為中心的自由基。值得一提的是，計算的質子親合勢與質譜實驗中得到的結果非常吻合，充分證實了所選模型和計算方法的可靠性。在氧化過程中，失去單

5、電子后的甘氨酰胺構象以兩個C原子之間鍵的顯著伸長為結構特征，并從理論上預測了-NH<,2>取代-OH會使得體系更容易被氧化。計算的價鍵型電子親合勢均為負值，表明在氣相中甘氨酰胺不能使得一個額外的電子填充到其最外層未占據軌道上。而在溶液中，絕熱電子親合勢變?yōu)檎?，表明甘氨酰胺能夠捕獲額外的電子而穩(wěn)定存在，從而為實驗上檢測到價鍵型甘氨酰胺陰離子的可能性提供了必要的理論依據。進而在電離勢和電子親合勢的基礎上得到的電負性、化學勢、化學軟(硬)度

6、等化學量也大大豐富了甘氨酰胺的相關性質。 (3)為考察水分子對順式肽鍵單元的結構和穩(wěn)定性的影響，我們分別探討了中性和質子化的甘氨酰胺中水分子參與的質子轉移過程。首先我們考察了在不同活性位點附近區(qū)域的水分子對甘氨酰胺直接異構化和單個水分子輔助異構化過程的影響。研究表明，在不同的活性位，水分子起到的作用有所不同：其一是促進質子轉移的發(fā)生，起到了誘導破壞甘氨酰胺分子的作用；其二是阻止質子轉移的發(fā)生，起到了保護甘氨酰胺分子的作用，這充分

7、體現了鄰近水分子對順式肽鍵單元的保護性和誘變性作用。進而我們又系統(tǒng)考察了一個水分子、兩個水分子和三個水分子以形成水鏈的方式參與的質子轉移過程，結果表明，以形成水鏈參與的輔助方式更有利于質子轉移的進行。不考慮其它因素的影響，兩個水分子參與的情況為最佳輔助方式，從而為其實驗上的相關研究提供了必要的理論依據。進一步的研究發(fā)現，質子轉移過程中的能壘高度與肽鍵單元中重原子鍵角的變化程度直接相關，即變化程度越大，需要克服的能壘越高，反之亦然。對質子

8、化甘氨酰胺的研究表明，一方面，在兩種質子化形式的異構化過程中，考慮到零點振動能(ZPVE)校正后，質子從羰基O位到氨基N位轉移過程中的能壘消失，表明后者的質子化形式占有絕對的優(yōu)勢；另一方面，對于發(fā)生在順式肽鍵單元中的異構化過程而言，在一個水分子輔助的情況下，由于存在較高的能壘使得質子轉移仍難以發(fā)生；而在二個水或者三個水分子輔助的情況下，考慮到ZPVE校正后使得質子從羰基O位到酰胺基N位轉移過程中的能壘同樣消失，進一步表明在中性和酸性條件

9、下順式肽鍵單元相對其異構體形式具有絕對的穩(wěn)定性。 (4)為考察順式肽鍵單元與鄰近的順式肽鍵單元或活性小分子之間的作用機制，我們用甲酰胺(甘氨酰胺)、甲酸(甘氨酸)和甲脒等三種類型的模型分子與甘氨酰胺形成雙氫鍵復合物來分別探討了不同(相同)順式肽鍵單元之間、活性羧酸殘基與順式肽鍵單元之間和A-T堿基對之間的雙質子轉移機制。結果表明，在質子轉移的過程中，由于不存在單質子轉移的中間體，因此雙質子轉移均以協同機理進行。對于前兩種類型的雙

10、質子轉移，在考慮到零點振動能(ZPVE)校正后，其逆向能壘全部消失，表明順式肽鍵單元不會因周圍其它順式肽鍵單元和各種羧酸基團的存在而發(fā)生結構上的誘變，這就從本質上預測了順式肽鍵單元的穩(wěn)定性。對于第三種類型的雙質子轉移，該模型能夠很好地反映出A-T堿基對之間的作用機制。從逆向能壘較低、轉移產物不易解離和質子轉移過程中無中間體存在等結果進一步證實了生物體中A-T堿基對的穩(wěn)定性。 (5)為系統(tǒng)考察單電子氧化對順式肽鍵單元結構和性質的影響

11、，基于上述雙氫鍵結合的中性復合物，我們進而又研究了其單電子氧化行為。結果表明，單電子氧化不僅使得雙氫鍵復合物在結構上發(fā)生較大的變化，而且因體系的不同氧化產物的性質也有所不同。對于由甲酰胺和甲酸參與的雙氫鍵復合物，單電子氧化均發(fā)生在甘氨酰胺分子片上，并且氧化產物具有與氧化前雙氫鍵強度相當的單氫鍵的特征。而對于由甘氨酸和甲脒分子參與的雙氫鍵復合物，在具有雙氫鍵結合模式的同時伴隨著單質子轉移的發(fā)生，從而產生具有“distonic”陽離子自由基

12、特征的氧化產物。因此，在實際的生物環(huán)境中，因鄰近活性分子的不同，單電子氧化對順式肽鍵單元造成的影響也有所不同。此外，溶劑效應和明顯水分子的參與也有利于單電子氧化的發(fā)生。 (6)如上所述，在由甲酰胺、甲酸和甘氨酸等參與的雙質子轉移過程中，出現了逆向能壘消失的現象，這與通常提到的低壘氫鍵的特征很相似。由于目前對低壘氫鍵是否在酶催化中具有重要作用的說法一直是眾多科學家爭論的焦點。因此，我們構建了合適的模型，旨在考察低壘氫鍵在絲氨酸蛋白

13、酶催化進程中的存在性及其意義。結果表明，在氣相中低壘氫鍵可以穩(wěn)定存在；溶劑效應對低壘氫鍵的存在性起著重要的調控作用。對于低壘氫鍵的作用，主要表現為兩部分：其一是由于質子的無能壘轉移，因此對于特定的反應體系而言，低壘氫鍵可以對外提供部分能量，即質子轉移前后的氫鍵作用能差；其二是作為常規(guī)氫鍵中的特殊群體，發(fā)揮著與常規(guī)氫鍵類似或者更優(yōu)的優(yōu)勢。進一步地，利用ONIOM分層算法對催化三聚體晶體結構的計算表明，在絲氨酸蛋白酶催化的?；^程中，盡管