熒光相關光譜與微流控芯片聯用單分子檢測技術研究.pdf

1、熒光相關光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS），是一種通過測定溶液中微區(qū)內（通常<10－15L）發(fā)光粒子由于運動或化學反應而產生的熒光漲落（熒光強度的明暗變化），并對熒光強度隨時間變化的函數進行統(tǒng)計分析，從中獲得粒子濃度、擴散系數、化學動力學參數等有關信息的分析方法。FCS于1972年由Magde等人基于波動光譜的概念提出。在其發(fā)展之初，由于計算機技術、光學技術以及光學檢測技術的限制

2、，人們一直無法減小照射體積、提高信噪比和靈敏度，技術發(fā)展緩慢。直到1993年，Rigler等人采用激光共焦技術使檢測體積降到10-15L以下，靈敏度得到顯著提高，自此FCS技術進入了快速發(fā)展通道。 以微流控芯片為代表的微型全化學分析系統(tǒng)(miniaturized total analysis system，?-TAS)，是當今分析領域的熱點。經過十余年的發(fā)展，其集成度不斷提高，同時對芯片中反應過程的表征手段提出了新的要求。熒光相

3、關光譜具有極高的靈敏度，對所分析的過程不產生機械干擾，能夠準確地反應微區(qū)內熒光粒子的濃度、遷移速率及化學反應動力學常數，且具有雙光束交叉相關譜等多種結構模式來適應不同的研究需要。因此，熒光相關光譜勢必將成為表征微流控芯片內部過程的有力方法，其二者的聯用技術顯示出廣闊的發(fā)展前景。 本論文基于激光共焦構型，構建了一套高靈敏度、高穩(wěn)定性的熒光相關光譜單分子檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用激光激發(fā)，用高數值孔徑物鏡使激光束聚焦，并用同一物鏡收集樣品

4、的熒光，單光子計數器用于實時記錄熒光信號，該熒光信號用相關器實時相關。整個系統(tǒng)保持物鏡焦點、針孔以及單光子計數器光敏區(qū)同軸。光學收集方面采取針孔與單光子計數器直接耦合，使光學收集效率得到更好的提高。在此FCS系統(tǒng)基礎上，建立了一套簡單有效的FCS與微流控芯片聯用裝置。該裝置通過顯微鏡與攝像頭對芯片通道進行放大成像，可以有效地輔助對焦工作。 本文發(fā)展了一套符合與FCS聯用要求的微流控芯片制作方法。該種微流控芯片采用聚二甲基硅氧烷（

5、PDMS）材料與蓋玻片雜交而成，經試驗證明，聯用系統(tǒng)中所得信號與開放體系中所得基本相同。本文同時對PDMS材料的選擇、蓋玻片的厚度校正及對焦方法等問題進行了討論。 熒光相關光譜在多組分分析時不用通過分離手段，直接采用數學擬合方法即可獲得不同組分的擴散系數。這是其優(yōu)點，但有時也限制了它的應用，特別是當組分間的分子量差異不很顯著時，常規(guī)熒光相關光譜就無法有效區(qū)分。為解決這個問題，van Orden等人首先將毛細管電泳技術與FCS聯用

6、，采用壓力驅動，利用電場力使不同組分產生淌度差，對分子量差別較小的R6G和R6G-dUTP混合物進行了組分比例分析，取得了良好的效果。但在試驗中由于毛細管側壁為弧形，使入射激光產生折射，造成焦點形狀畸變，所得關聯函數用理論模型擬合效果較差，需要額外做條件實驗并引入參數對理論模型進行修正。本文利用微流控芯片代替毛細管與FCS聯用，由于芯片底部為厚度均勻的蓋玻片封裝，因此不會對激光造成不良影響。這種改變不僅可以簡化實驗過程、提高準確率，還可

7、以有效降低樣品需求量、減小電泳焦耳熱效應。文中應用自組裝FCS與微流控芯片聯用系統(tǒng)對分子量相近混合物體系：不同比例的羅丹明綠琥珀酸脂與熒光素混合物（常規(guī)熒光相關譜無法區(qū)分）在單分子水平上進行了分析，取得了令人滿意的分析結果。該方法有效地拓展了熒光相關光譜的應用范圍，特別適合物質相互作用研究。文中還對FCS數據處理方法中的一些問題進行了討論。 FCS與微流控芯片聯用技術還可以進一步應用于分子相互作用研究、通道內物質遷移機理研究、與