鮑魚內臟蛋白肽的制備及其體外活性研究.pdf

1、利用鮑魚內臟制備具有生物活性的蛋白肽，是實現(xiàn)鮑魚資源綜合利用的有效途徑。本研究以鮑魚內臟為原料，通過酶解、超濾制備蛋白肽，初步探討鮑魚蛋白肽分離組分和抗氧化活性之間的關系。然后，對鮑魚蛋白肽進行分離純化，對獲得的抗氧化肽進行質譜分析。最后，考察鮑魚蛋白肽對氧化損傷的人皮膚細胞和人腫瘤細胞增殖的影響。
　　首先，本文利用超濾膜對鮑魚內臟酶解物進行分離，考察了各分子量段酶解物的成分組成和抗氧化活性。利用截留分子量為10000 Da、3

2、000 Da、500 Da的超濾膜分離得到FA、FB、FC和FD四個組分中，F(xiàn)A組分的總糖和蛋白含量分別為34.06％和17.20％，而FB、FC和FD等組分主要是由蛋白組成，其游離氨基酸含量分別高達23.20 g/100 g，25.47 g/100g和28.68 g/100 g。根據Tricine-SDS-PAGE、液相色譜和β-消除反應的分析結果，表明FA組分含有N-糖苷鍵結合的糖蛋白和分子量25 kDa的蛋白，F(xiàn)B、FC和FD的分

3、子量主要分布在300 Da左右。體外抗氧化結果表明，F(xiàn)D組分具有較好的清除自由基活性。
　　其次，在鮑魚內臟蛋白肽小試放大試驗中，利用截留分子量為10000 Da、1000 Da、200 Da膜分離得到FA、FB和FC三個組分。FA組分的總糖和蛋白含量分別為21.49％和55.12％，而FB和FC主要由蛋白肽構成。氨基酸組成分析結果顯示，在FC組分中疏水性氨基酸(Leu、Phe和Tyr)含量最高。三個分離組分主要含有鉀、鈉、磷等礦

4、物質。根據蛋白肽抑制亞油酸自動氧化的結果，發(fā)現(xiàn)FC組分具有最高的抗氧化能力。FC組分經凝膠柱和反向色譜分離后，獲得分子量440.0154 Da酪氨酸肽和分子量522.1545 Da苯丙氨酸肽。
　　最后，考察了AVP對人皮膚細胞和人腫瘤細胞的影響。結果發(fā)現(xiàn)，鮑魚內臟蛋白肽對HSF細胞的增殖效果明顯優(yōu)于HaCat細胞。在H2O2誘導的細胞氧化損傷模型中，經1.00-4.00 mg/mL的AVP預孵后能明顯提高HSF細胞存活率、提高細

5、胞外SOD、GS H-Px以及細胞內SOD活性、降低細胞MDA含量。經0.25-4.00 mg/mL的AVP預孵后雖然能明顯提高HaCat細胞存活率，但只有1 mg/mL的AVP能明顯提高HaCat細胞外GSH-Px活性以及胞內GSH-Px和SOD活性，并使胞內MDA含量出現(xiàn)一定程度的下降。另一方面，當培養(yǎng)液含濃度＞2.00 mg/mL的AVP時，MDA-MB-231細胞和HepG2細胞的生長都得到明顯的抑制，而且MDA-MB-231細

6、胞的存活率明顯低于HepG2細胞。根據細胞形態(tài)學觀察的結果，當腫瘤細胞生長受到抑制時，MDA-MB-231細胞會收縮變圓，而HepG2細胞結團數目減少、細胞體積變小，兩種細胞都可以發(fā)現(xiàn)活細胞減少、凋亡細胞增加。不管是MDA-MB-231細胞還是HepG2細胞，在瓊脂糖電泳中都沒有發(fā)現(xiàn)DNA降解片段。
　　綜上所述，酶解結合超濾制備的鮑魚內臟蛋白肽具有較好的抗氧化活性，其酪氨酸肽和苯丙氨酸肽是主要的抗氧化成分。低濃度的蛋白肽能促進人