水稻OsIPCS 家族基因的結構與表達分析.pdf

1、肌醇磷酸神經酰胺合酶（Inositolphosphorylceramide synthase，IPCS）能夠催化磷酸肌醇與神經酰胺生成肌醇磷酸神經酰胺，是植物鞘脂合成途徑中的一種關鍵酶。植物IPCS家族基因在植物的生長發(fā)育和逆境適應中具有重要作用，有關植物IPCS家族基因的克隆、表達分析和功能的研究報道較少。水稻基因組中存在3個OsIPCS基因：OsIPCS1、OsIPCS2和OsIPCS3，到目前為止，對水稻OsIPCS家族基因的表達

2、特性和基因功能的研究報道非常有限。
　　本研究以粳稻中花11為材料，采用RT-PCR等方法克隆了3個水稻OsIPCS家族基因；通過生物信息學等方法分析了OsIPCS家族基因的序列特點、蛋白質保守結構域和系統(tǒng)發(fā)生樹等；基于qRT-PCR等方法對正常和逆境下OsIPCS家族基因在水稻不同組織部位的表達特性進行了分析；利用pCXUN質粒構建了OsIPCS2和OsIPCS3基因的過量和下調表達載體，以農桿菌介導法轉化水稻，獲得了OsIPC

3、S2和OsIPCS3基因的過量和下調表達轉基因植株；此外，還利用煙草葉片瞬時表達法對預測的OsIPCS蛋白進行了亞細胞定位分析，為進一步研究水稻OsIPCS家族基因的生物學功能奠定了基礎。主要研究結果如下：
　　1.水稻OsIPCS家族基因的生物信息學分析
　　3個OsIPCS基因分布于第1和第5號染色體上，它們分別含有12到13個外顯子。結合擬南芥、玉米和大豆等的IPSC基因序列分析發(fā)現(xiàn)：大多數植物IPCS基因都含有11個

4、內含子，說明這可能是植物IPCS家族基因的保守特征。蛋白序列分析結果也表明，3個預測的水稻OsIPCS蛋白中均具有典型的植物IPCS家族蛋白特征，即具有高度保守結構域D3和D4。系統(tǒng)進化樹分析結果表明大多數植物IPCS蛋白可以劃分為單子葉組和雙子葉組，OsIPCS1和OsIPCS2聚集在一個分支上而OsIPCS3位于另一分支上。
　　對3個候選的水稻OsIPCS基因的啟動子分析發(fā)現(xiàn)，3個基因有幾種相同的順式作用元件如ABRE、MB

5、S、Skn-1_motif和circadian等，表明3個基因可能在植物的生長發(fā)育和外源激素以及非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。OsIPCS家族基因的啟動子序列中也有響應生物脅迫的順式作用元件，如OsIPCS3的啟動子中有真菌誘導子響應元件Box_W1；OsIPCS1的啟動子中有防御和應激反應性的TC-rich repeats。
　　2.正常和逆境下OsIPCS家族基因在水稻不同組織部位的表達分析
　　熒光定量表達分析結果表

6、明，在正常生長情況下，3個候選的OsIPCS基因在水稻幼苗的根、莖、葉和孕穗期的幼穗中均有表達，說明OsIPCS基因可能在水稻生長發(fā)育過程中具有重要作用；并且3個OsIPCS基因在水稻不同組織部位中的表達量存在明顯差異，其中OsIPCS1和OsIPCS2的表達量均為幼穗>葉>根>莖，OsIPCS3則為葉>幼穗>根>莖，說明OsIPCS基因在功能上可能存在不同。在低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫下，3個OsIPCS基因的表達模式也存在明顯的差

7、異，例如低溫脅迫下，OsIPCS1和OsIPCS2在水稻幼苗的根和莖中均顯著上調表達，在葉中則下調表達；而OsIPCS3在水稻根、莖和葉中均顯著上調表達；推測OsIPCS家族基因可能在水稻的逆境適應過程中也發(fā)揮著重要的作用，且3個OsIPCS基因可能存在功能上的分化。
　　3.水稻OsIPCS2和OsIPCS3的過量和下調表達載體構建及遺傳轉化
　　在利用RT-PCR等方法克隆了3個水稻OsIPCS家族基因的基礎上，利用pC

8、XUN分別構建了OsIPCS2和OsIPCS3基因的過量和下調表達載體，通過農桿菌介導法成功轉化粳稻中花11，總計篩選和鑒定到了160個陽性T0代轉基因水稻植株，目前已經鑒定獲得了OsIPCS2和OsIPCS3的過量表達轉基因T2代種子和下調表達轉基因T1代種子。為進一步分析OsIPCS2和OsIPCS3基因在水稻生長發(fā)育和逆境適應中的生物學功能奠定了基礎。
　　4.水稻OsIPCS蛋白的亞細胞定位
　　利用WoLF PSO

9、RT在線軟件對3個OsIPCS蛋白的亞細胞定位情況進行預測，結果表明OsIPCS1在細胞溶質、內質網、線粒體、質膜和液泡中均有表達，OsIPCS2在細胞溶質、細胞溶質_細胞核、細胞核、質膜、內質網和液泡中均有表達，OsIPCS3在線粒體、線粒體_葉綠體、葉綠體和細胞質_線粒體中有表達。進而，我們構建了OsIPCS1和OsIPCS2蛋白與綠色熒光蛋白GFP的融合表達載體，煙草瞬時表達結果初步表明：OsIPCS2蛋白可能在細胞核、質膜和其他