單分子水平研究活細胞中胰島素與其受體復合物的運動、聚集及內(nèi)吞.pdf

1、全文分為四章： 本文第一章對單分子檢測(SMD)的意義作了簡單的介紹。SMD技術在生命科學上的應用可以在單分子水平上揭示分子的動態(tài)行為、動力學過程和機制，并發(fā)現(xiàn)大量分子集合體中分子個體的性質(zhì)和行為。這項技術已被大量應用于研究細胞外和活細胞內(nèi)的生物大分子，目前成為深入了解生物體系中生物分子的結構、性質(zhì)和相互作用等信息的新方法。這一章中我們還對幾種在生物大分子SMD中應用較為廣泛的技術：全內(nèi)反射熒光顯微術(TIRFM)、激光掃描共聚

2、焦熒光顯微術(LSCFM)、近場掃描光學顯微術(NSOM)、多光子激發(fā)熒光顯微術(MPEM)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、熒光壽命成像(FLJM)和熒光相關光譜(FCS)等進行了綜述。其中對TIRFM的綜述已發(fā)表在陳宜張、林其誰主編的《生命科學中的單分子行為及細胞內(nèi)實時檢測》一書中(2005年，198-218頁，科學出版社，北京)。 第二章中我們發(fā)展了一種簡單的細胞內(nèi)熒光顯微術。此方法是將激光調(diào)節(jié)到在細胞上表面發(fā)生全內(nèi)反射，此

3、時激光只照射到細胞內(nèi)部，減少了噪音，使分辨率大大提高。我們從理論上對這種方法進行了分析，并以實例進行了驗證。這種技術相對于已有各種SMD技術能更方便的觀測細胞質(zhì)膜上表面、細胞內(nèi)部或細胞質(zhì)膜下表面的單個熒光生物大分子，并可獲得高分辨率圖像。細胞內(nèi)熒光顯微術具有以下幾個顯著特點: 1．可在單分子水平上對貼壁細胞上表面觀測，彌補了常規(guī)全內(nèi)反射熒光顯微術無法觀測細胞上表面的缺陷，避免了細胞在貼壁狀態(tài)固定細胞的玻片對細胞的生命過程造成的不

4、利影響，使得對活細胞生命過程的研究更方便，得到的結果更可靠，甚至可以研究用常規(guī)全內(nèi)反射熒光顯微術無法研究的事件。 2．可對細胞內(nèi)不同位置成像。這種技術只檢測細胞內(nèi)的熒光，而不檢測細胞外的熒光。與檢測細胞內(nèi)、外熒光的常規(guī)的落射熒光顯微術(Epi-FM)相比較，這種技術獲得熒光圖像的分辨率和對比度更高。 3．對細胞下表面成像也能達到與常規(guī)的細胞下表面全內(nèi)反射熒光顯微術相當?shù)姆直媛?，并能用于細胞下表面的單分子檢測。 4

5、．與傳統(tǒng)的方法比較，能夠快速對細胞不同區(qū)域進行觀測，這對于研究分子在細胞內(nèi)的運動及位置變換具有突出的優(yōu)勢。 此部分內(nèi)容已被Talanta接收，全文已在網(wǎng)上刊登，正待印刷。 第三章中我們以第二章所提出的細胞內(nèi)熒光顯微術，結合落射熒光顯微術(Epi-FM)和激光掃描共聚焦熒光顯微術(LSCFM)，對活的人正常肝細胞HL-7702中胰島素受信號轉(zhuǎn)導早期階段在單分子水平進行了研究。信號分子胰島素(insulin)與細胞質(zhì)膜上胰島

6、素受體(IR)結合可產(chǎn)生一系列生理現(xiàn)象，其早期過程包括質(zhì)膜上胰島素與胰島素受體的復合物(IR-insulin)的運動、聚集以及內(nèi)涵體的形成等，這些現(xiàn)象在早期曾用形態(tài)學、生物化學等方法進行研究，但大多將大量細胞溶解后通過直接測量放射性標記物或熒光標記物的強度進行判斷。由于受大量細胞平均化檢測方法的限制，無法動態(tài)觀察這些過程。我們在單分子水平上對細胞質(zhì)膜上IR-insulin的運動、聚集以及內(nèi)涵體的形成進行了實時動態(tài)研究，觀察到如下的一些現(xiàn)

7、象： 1．在實時追蹤質(zhì)膜上IR-insulin的聚集過程時，發(fā)現(xiàn)聚集體中含有IR-insulin的個數(shù)不均一，有兩個IR-insulin復合體同時聚集，也有三個IR-insulin復合體同時聚集；而且聚集體形成過程也不相同。此外，還觀察到了質(zhì)膜上IR先捕獲溶液中insulin，然后通過擴散運動與質(zhì)膜上另一個已形成的IR-insulin復合體聚集，隨后又有一分子insulin被質(zhì)膜上瓜捕獲，并且與前面形成的含有兩個IR-insul

8、in的聚集體聚集，形成了三個瓜．insulin的聚集體。此實驗結果反映出了單個聚集體形成方式的多樣性和時間上的不同步性，這在大量分子平均研究中是不能夠體現(xiàn)出來的。 2．我們根據(jù)熒光強度分析了56個聚集體中含有IR-insulin復合體的個數(shù)。發(fā)現(xiàn)聚集體中含IR-insulin復合體由2個到14個不等。含IR-insulin復合體個數(shù)少的聚集體的數(shù)量多，含IR-insulin復合體個數(shù)多的聚集體的數(shù)量少。并對這些現(xiàn)象的成因進行了解

9、釋。 3．在對同一細胞的質(zhì)膜下表面和上表面聚集體的觀察中，發(fā)現(xiàn)細胞上表面IR-insulin聚集體較細胞下表面明顯多，因為細胞下表面質(zhì)膜貼壁與玻片接觸較緊密，不利于膜上IR的運動，這反映出了單個細胞不同部位受外界影響而產(chǎn)生的不同反應。 4．通過比較胰島素受體抗體(anti-IR)和insulin與IR的作用，證明了上述所觀察到的現(xiàn)象是由于insulin誘導產(chǎn)生的。 上述在單分子水平上的研究的結果描述了在insu

10、lin刺激下活細胞上瓜的一些未見報道的生理現(xiàn)象。 在第四章中我們用第二章所提出的細胞內(nèi)熒光顯微術及全內(nèi)反射熒光顯微術(TIRFM)在活體狀態(tài)下實時觀測了人正常肝細胞HL-7702質(zhì)膜上IR介導的內(nèi)吞及生成的內(nèi)涵體。由于研究受體介導入胞的機制對于了解胞內(nèi)信息傳遞途徑有重要意義，目前已有多種方法用于研究內(nèi)吞和囊泡運輸。如采用電鏡或生化方法等來觀察到內(nèi)吞的配體在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑和獲得動力學信息，但是這些方法只能得到靜態(tài)圖片或以破壞細胞

11、結構和囊泡轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的完整性來獲得大量分子的平均結果。我們則在活細胞狀態(tài)下進行研究，結果反映出了囊泡間和分子間的個體差異。研究內(nèi)容主要有幾下幾方面： 1．觀察到了細胞質(zhì)膜上單個IR-insulin復合體和胞內(nèi)m-insulin內(nèi)涵體。通過anti-IR作用于細胞質(zhì)膜瓜的對比實驗，分析了insulin對IR誘導活化作用和細胞對瓜循環(huán)代謝過程的兩種不同現(xiàn)象，說明了胞內(nèi)IR-insulin內(nèi)涵體的生成是由于insulin對IR的活化作用

12、。 2．通過觀察囊泡在胞內(nèi)的運輸發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜上單個IR-insulin復合體數(shù)量增多后，胞內(nèi)內(nèi)涵體才出現(xiàn)。早期內(nèi)體在近膜區(qū)形成后，晚期內(nèi)體才沿核周圍形成。 3．在實時觀測IR-insulin聚集體內(nèi)吞過程中，發(fā)現(xiàn)聚集體從質(zhì)膜表面內(nèi)吞進入胞內(nèi)的速度是不均一的，進入胞內(nèi)的速度是一個由慢到快再到慢的過程。我們從生理過程對這一現(xiàn)象進行了解釋。 4．通過對胞內(nèi)單個內(nèi)涵體連續(xù)觀測，還發(fā)現(xiàn)內(nèi)涵體的運動呈不規(guī)則變化，但是這些變化均