海洋假單胞菌來源的新型海藻糖合成酶的基因克隆、表達及性質研究.pdf

1、海藻糖是一種穩(wěn)定的非還原二糖廣泛存在于多種生物體內。由于其性質特殊，海藻糖在生物醫(yī)藥、食品、化妝品等多個領域有廣泛的應用，但其市場應用由于生產(chǎn)成本過高而受到限制。目前在生物體內已經(jīng)鑒定了至少5條海藻糖合成酶途徑。在這5條途徑中，海藻糖合成酶(trehalose synthase，TreS)途徑是以低成本的麥芽糖為底物，通過轉糖基作用一步法生成海藻糖，具有良好的工業(yè)應用前景。
　　 海洋是一個復雜的生態(tài)大環(huán)境，具有高鹽、高壓、低溫

2、、缺氧等一系列復雜的特點，來源于海洋微生物的酶通常具有一些特殊的酶學性質。此外，海藻糖能夠在極端環(huán)境下對微生物產(chǎn)生保護作用，海洋微生物為了能在海洋中生存需要產(chǎn)生較多的海藻糖來對抗環(huán)境壓力。因此，從海洋微生物中篩選具有潛在工業(yè)應用價值的新型TreS是一個非常有用的途徑。
　　 目前，雖然已有多篇來源于不同物種的TreS的克隆、表達及性質研究的文獻報道，但還沒有一個關于海洋微生物來源的TreS的相關報道。在本研究中，通過篩選本課題組

3、的海洋微生物菌株庫，我們獲取了一個新型的海洋微生物來源的tres基因。我們將該tres基因在大腸桿菌中重組表達并將重組蛋白純化。此外，我們對該酶可能參與底物結合或催化的重要殘基進行了鑒定，并對該酶催化麥芽糖和海藻糖相互轉化過程中可能的機制也進行了探討。
　　 第一部分:新型tres基因的獲取、克隆、表達及純化
　　 首先，從171株海洋微生物菌株中我們篩選到一個TreS高產(chǎn)菌株P8005。通過設計簡并引物與PCR擴增，我

4、們獲得了一長648 bp的核心序列。隨后，通過TAIL-PCR，我們獲取了一個長度為3369bp，編碼1122 aa，理論分子量大小為126kDa的開放式閱讀框。通過氨基酸序列比對，我們發(fā)現(xiàn)該序列與文獻已報道的海藻糖合成酶序列一致在29％-35％之間。該序列已提交至Genbank數(shù)據(jù)庫(Genbank Accession No: JQ951963)。該序列被命名為G526。
　　 隨后，我們以pET-32a為原核表達載體，構建了

5、重組表達載體pET-32a-G526，并將該重組載體導入大腸桿菌BL21(DE3)中進行了重組表達。經(jīng)過IPTG誘導后，成功誘導出大量重組蛋白(rG526)。含有重組蛋白的菌體經(jīng)過超聲破碎、離心得到的上清液，用Ni柱進行親和純化，純化后得到的蛋白經(jīng)蛋白電泳分析為單一條帶，大小為141 kDa(含親和標簽)，與理論值一致。
　　 第二部分:rGS26重組蛋白的酶學性質研究
　　 我們以麥芽糖和海藻糖為底物對rG526的酶學

6、性質進行研究。rG526能夠催化麥芽糖和海藻糖的相互轉化，反應達到平衡點時麥芽糖和海藻糖間的比例大約是7∶3。此外，該酶在催化麥芽糖生成海藻糖的過程中還生成一定量的葡萄糖（占總產(chǎn)物的5％）。經(jīng)過動力學參數(shù)測定，發(fā)現(xiàn)相比海藻糖，rG526對麥芽糖具有較高的親和力和催化效率(Km/kcat)。rG526的最適反應溫度和最適反應pH分別是37℃和pH7.2。該酶在0℃-40℃溫育1h能保持85％以上活性，當保溫溫度超過50℃，酶的活性只能保持

7、原來的10％。不同的金屬離子和抑制劑對酶的活性有一定的影響，其中Cu2+和SDS對酶的活性有顯著抑制作用。K+濃度對酶的活性有顯著影響，K+濃度在20-40mM時，rG526具有最高的催化活性。
　　 第三部分:rG526重要功能殘基鑒定與催化特性研究
　　 通過序列比對，我們發(fā)現(xiàn)G526的氨基酸序列與結構已知蛋白的海藻酮糖合成酶MutB(PDB:1_ ZJA)的氨基酸序列一致性較高（N端一致性達32％）。我們以MutB

8、的三維結構作為模板，對G526進行同源建模。同源建模結果顯示了G526中的一些殘基可能參與催化或與底物發(fā)生作用。通過定點突變實驗，我們發(fā)現(xiàn)，D78A、Y81A、H121A、D219A、E261A、H331A和D332A殘基的突變會使G526活性大幅降低。此外，我們還對rG526的催化特性進行了研究。通過同位素底物標記實驗證實，二氘標記的海藻糖和未標記的海藻糖經(jīng)過酶的催化反應產(chǎn)生的是二氘標記的二糖以及未標記的二糖。另外，7個氘標記的葡萄糖

9、不會在反應過程中摻入到二糖中，說明該酶的催化機制為分子內轉糖基的反應機制。
　　 結論:
　　 在本研究中我們從海洋假單胞菌中獲得了一新型的TreS。該TreS能夠催化麥芽糖和海藻糖之間的相互轉化并且其平衡點朝向生成海藻糖的方向，該結果表明該酶可能具有潛在工業(yè)應用價值。在本研究中還找到一些可能參與催化或底物結合的重要殘基:D78、Y81、H121、D219、E261、H331、D332A。這些氨基酸殘基可作為候選殘基進一