苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)pk-1基因的克隆與表達.pdf

1、桿狀病毒是一類有著桿狀病毒粒子的DNA病毒，其基因組為90～180Kb的雙鏈環(huán)狀 DNA。目前，昆蟲病毒研究活躍在病毒研究的各個領域，占據(jù)著了生命科學研究的顯著地位，擁有著廣闊的發(fā)展前景。蛋白激酶(Protein kinase,PK)具有將ATP的γ-磷酸基轉移到蛋白質特定的氨基酸殘基上的潛在催化能力，從而使蛋白質磷酸化。在DNA復制和有絲分裂過程中蛋白激酶起調(diào)節(jié)作用，在轉錄過程也起到重要作用。在許多病毒侵染過程中，蛋白激酶和蛋白的磷酸

2、化作用起到至關重要的作用。病毒粒子與蛋白激酶的活性相互關聯(lián)，甚至是病毒DNA釋放的基礎。同時，PK-1是AcMNPV中一種極晚期基因轉錄起始復合體的組分，因此，體外獲得PK-1蛋白對研究其功能有重要意義。
　　本實驗將AcMNPV pk-1基因進行克隆，并在原核和真核系統(tǒng)中分別表達。根據(jù)GenBank中提交的AcMNPV pk-1基因序列利用Primer5.0軟件進行引物設計，對中國科學院動物所重點實驗室贈與的AcMNPV基因組D

3、NA進行PCR擴增得到長度為819bp的目的DNA片段pk-1。構建原核表達和真核表達的重組質粒pk-1/pGEX4T1、pk-1/pET30a、pk-1/pFast HF Tb，酶切和測序鑒定，結果表明，三個重組質粒構建成功。將pk-1/pGEX4T1、pk-1/pET30a轉化E.coli BL21，16℃IPTG誘導大量表達。將pk-1/pFast HF Tb在DH10Bac感受態(tài)中進行轉座（同轉化過程），通過藍白斑篩選獲得陽性克

4、隆，LB-TGK培養(yǎng)基培養(yǎng)后收集細胞，轉染Sf9。利用Western blot對第一代病毒進行檢測，確定PK-1蛋白在Sf9細胞中已表達。擴培第二代病毒使PK-1進行大量真核表達。利用親和層析技術對表達成功的PK-1蛋白進行純化，所用特異結合材料為GSH、Ni柱子和Flag抗體。SDS-PAGE檢測表達和純化效果，結果表明，分別得到大小為58kDa、33kDa、34kDa的PK-1融合蛋白，其蛋白濃度分別為0.45mg/mL、0.68m