體外共培養(yǎng)條件下定向誘導人羊膜間充質干細胞向人前交叉韌帶成纖維細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：
　　1）探討人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）是否具有MSCs的特性及純度。
　　2）比較膠原酶消化法與原位組織塊培養(yǎng)法對分離人前交叉韌帶成纖維細胞（human anterior cruciate ligament fibroblasts，hACLFs）的效果；探討使用堿性成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)G

2、F）作用于人前交叉韌帶成纖維細胞后細胞形態(tài)學改變、增殖及相關基因和蛋白表達的效應。
　　3）探討體外聯(lián)合生長因子行單純誘導、單層共培養(yǎng)及Transwell共培養(yǎng)定向誘導人羊膜間充質干細胞向人前交叉韌帶成纖維細胞分化的效果。
　　方法：
　　1）取產婦胎盤用胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法分離獲得hAMSCs。流式細胞術分析鑒定hAMSCs表型分子，CCK-8法檢測hAMSCs增殖活性，免疫熒光染色檢測第3代hAMSCs的CK-1

3、9和波形蛋白表達。分別使用茜素紅、甲苯胺藍及油紅O染色法檢測7d和21d時hAMSCs向成骨、成軟骨及成脂細胞分化后的效果。對成骨細胞行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性檢測。實時熒光定量PCR檢測向成骨、成軟骨及成脂細胞誘導7d、21d時相關基因表達水平。
　　2）分別使用膠原酶消化法和組織塊原位培養(yǎng)法分離hACLFs，倒置相差顯微鏡觀察兩種方法分離的細胞形態(tài)，CCK-8法檢測兩種分離方法細胞增殖

4、能力；流式細胞術檢測hACLFs細胞表型；使用bFGF培養(yǎng)第3代hACLFs后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、CCK-8法檢測細胞增殖活性，分別在第7d、10d及14d時行免疫熒光染色觀察細胞I、III型膠原，纖維連接蛋白（Fibronectin）及細胞連接素（Tenascin-C）的表達，實時熒光定量PCR及蛋白免疫印跡試驗（Western blot）檢測韌帶相關基因及蛋白水平改變。
　　3）聯(lián)合應用轉化生長因子-β1(trans

5、forming growth factor-β，TGF-β1）和bFGF作為誘導劑置于LG-DMEM/F12培養(yǎng)基中。使用第3代hAMSCs和hACLFs，按照單純誘導、單層共培養(yǎng)及Transwell共培養(yǎng)進行分組：單純誘導組（A組）、單純非誘導組（B組）、單層共培養(yǎng)誘導組（C組）、單層共培養(yǎng)非誘導組（D組）、Transwell共培養(yǎng)誘導組（E組）及Transwell共培養(yǎng)非誘導組（F組）。共培養(yǎng)組兩種細胞密度調整為104/ml比例為1

6、:1，其中C、D兩組中的hACLFs在共培養(yǎng)前24h內使用Arab-C（終濃度為5μg/ml）以特異性殺滅處于S期的成纖維細胞。倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)。CCK-8法檢測各組細胞的增殖活性，分別于7d、14d和21d時：免疫熒光染色觀察各組細胞I、III型膠原，F(xiàn)ibronectin及Tenascin-C的表達情況，實時熒光定量PCR法檢測各組韌帶相關基因表達水平，苦味酸天狼猩紅染色法觀察各組細胞總膠原表達，Western blo

7、t檢測各組細胞中韌帶相關蛋白的表達。
　　結果：
　　1）胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法可獲得大量可穩(wěn)定增殖的hAMSCs。流式細胞術鑒定結果表明hAMSCs表達MSCs表型。第3代hAMSCs高表達波形蛋白，低表達CK-19。茜素紅染色顯示，成骨誘導后細胞存在多個礦化結節(jié)，細胞中堿性磷酸酶活性明顯增加；甲苯胺藍染色顯示，成軟骨誘導后細胞基質中分泌大量的糖胺聚糖；油紅O染色顯示，成脂誘導后，細胞漿內可見脂滴。實時熒光PCR結果顯示，

8、成骨、成軟骨及成脂誘導21d后，相關基因表達較7d時明顯增高（P<0.05）。
　　2）流式細胞術結果顯示體外分離的hACLFs表達成纖維細胞相關表型分子。使用兩種分離方法分離的細胞形態(tài)學在傳至第2代時發(fā)生改變，組織塊原位培養(yǎng)法分離的細胞數量更多，呈長梭形、雙極樣生長，形態(tài)更加趨近于成纖維細胞，膠原酶消化法分離的細胞數量較少，呈短棒、不規(guī)則狀。組織塊原位培養(yǎng)法分離的hACLFs增殖能力顯著高于膠原酶消化法（P<0.05）。bFGF

9、作用于第3代hACLFs后，細胞增殖能力顯著提高（P<0.05），細胞呈長梭形、成纖維樣生長且極性明顯。免疫熒光染色顯示使用bFGF培養(yǎng)的細胞其I、III型膠原，F(xiàn)ibeonectin和Tenascin-C表達有顯著提高；PCR結果顯示bFGF培養(yǎng)組中I、III型膠原、Fibronectin、Tenascin-C，基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、賴氨酰氧化酶-1（lysyl oxi

10、dase-1，LOX-1）的mRNA表達水平顯著上調（P<0.05）。Western blot結果顯示加入 bFGF培養(yǎng)的hACLFs其 I、III型膠原蛋白表達水平顯著高于對照組（P<0.05）。
　　3）使用誘導因子的各組其細胞增殖水平顯著高于未使用誘導因子組（P<0.05）。免疫熒光染色顯示I、III型膠原，F(xiàn)ibeonectin和Tenascin-C表達水平隨時間延長而增加，使用誘導因子各組蛋白表達水平高于非誘導組，其中T

11、ranswell共培養(yǎng)誘導組于21d時蛋白表達較其他組更高。PCR結果顯示I、III型膠原、Fibronectin、Tenascin-C， MMP-2、LOX-1、α-肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的mRNA表達水平于14d和21d時顯著上調（P<0.05），Transwell共培養(yǎng)誘導組于21d時，I、III型膠原、MMP-2、LOX-1、α-SMA其表達高于其他組。Western blot結果顯示

12、Transwell共培養(yǎng)誘導組于21d時I、III型膠原蛋白表達水平顯著高于其他組（P<0.05）?？辔端崽炖切杉t染色結果顯示21d時Transwell共培養(yǎng)誘導組總膠原水平最高，較其他組有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：
　　1) 人羊膜間充質干細胞具有MSCs的特征并且可以向成骨細胞，軟骨細胞及脂肪細胞的潛能，可選作為組織工程學的種子細胞。
　　2）體外成功分離hACLFs，并表達成纖維細胞的表型分子；證實

13、組織塊原位培養(yǎng)法分離的細胞增殖效率更高,獲得細胞數量更多，形態(tài)學更趨近于成纖維細胞。
　　3）bFGF可提高hACLFs體外增殖能力,細胞形態(tài)更趨向成纖維細胞特性,韌帶相關特異性基因及蛋白表達增加。
　　4）bFGF聯(lián)合TGFβ-1可促進hAMSCs向hACLFS分化；單層共培養(yǎng)與Transwell共培養(yǎng)較單純誘導方法,細胞分化效果更加明顯；在基因、蛋白及膠原分泌水平上, Transwell共培養(yǎng)方式比單層共培養(yǎng)誘導效果更強