基于c-FLIP和內質網應激通路相互作用探討解毒方改善索拉非尼耐藥的作用機制.pdf

1、背景:索拉非尼(Sorafenib，Sora)是臨床上治療中晚期肝癌推薦使用的分子靶向治療藥物，但是在治療過程中會出現各種副作用，更重要的是，有相當一部分病人會對sorafenib產生耐藥。當前針對sorafenib耐藥的機制研究紛繁復雜，涉及諸多信號通路和生物分子，然而目前的研究尚不能全面揭示sorafenib耐藥的機制。文獻報道，sorafenib可以激活CD95/Fas誘導外源性凋亡，而caspase-8是外源性凋亡途徑中重要的起

2、始蛋白，caspase-8激活后可以引起一系列級聯反應。c-FLIP是caspase-8的重要抑制蛋白，在許多腫瘤中高表達，與凋亡抑制密切相關。同時c-FLIP位于內質網(Endoplasmic reticulum，ER)膜上，具有調節(jié)內質網應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)的作用，而后者與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，參與化療藥物抵抗。由此我們設想，c-FLIP/ERS信號通路是否參與調節(jié)sorafeni

3、b耐藥，是引起sorafenib耐藥的機制之一？同時，課題組成員在中醫(yī)藥防治肝癌方面具有一定的研究基礎且具有豐富的臨床經驗，并在長期的臨床研究中總結經驗和用藥，歸納出中藥小復方“解毒方”(Jiedu Fang，JDF)，以此方為基礎開展的多中心臨床研究發(fā)現，可以延長晚期肝癌患者的生存期，尤其是部分sorafenib耐藥或者副作用較大的病人。中醫(yī)藥在逆轉腫瘤化療耐藥方面具有獨特的優(yōu)勢，那么中藥小復方“解毒方”能否可以改善索拉非尼耐藥，其機

4、制是否涉及調節(jié)c-FLIP/ERS?
　　研究目的:1.構建sorafenib耐藥人肝癌細胞株，并觀察sorafenib對敏感/耐藥肝癌細胞增殖和凋亡的影響。2.分別觀察sorafenib對敏感/耐藥肝癌細胞株ERS及下游凋亡和自噬通路的作用，并研究c-FLIP對ERS和相關凋亡通路的影響，探討其調節(jié)耐藥的可能機制。3.體外探討解毒方改善sorafenib耐藥是否通過調節(jié)c-FLIP與ERS相關通路發(fā)揮作用。4.進一步在體內論證解

5、毒方聯合sorafenib對于耐藥肝癌細胞皮下移植瘤的抑制作用。
　　研究方法:1.采用HepG2、Huh7肝癌細胞，通過MTT篩選sorafenib藥物濃度，選擇略低于IC50的藥物濃度開始長期持續(xù)的sorafenib藥物干預，誘導為HepG2-R、Huh7-R耐藥肝癌細胞株，通過MTT、流式分別檢測細胞增殖、凋亡，驗證耐藥細胞株HepG2-R、Huh7-R是否構建成功。2.觀察ERS相關通路在sorafenib耐藥中的作用，并

6、采用ERS抑制劑4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）反相驗證，進一步比較敏感株和耐藥株中ERS引起的凋亡及自噬情況，WB檢測相關蛋白表達，電鏡下觀察自噬體的形成，研究ERS在sorafenib耐藥中的作用。3.根據ERS對相關凋亡通路的影響，觀察凋亡抑制蛋白c-FLIP在sorafenib耐藥中的作用，并采用siRNA干擾技術及過表達技術進行驗證。4.體外觀察解毒方對sorafenib耐藥的改善作用，并通

7、過Westernblot檢測聯合用藥對c-FLIP和ERS蛋白的影響，探討其可能機制。5.通過構建soranfenib耐藥人肝癌細胞株皮下移植瘤裸鼠模型，在體內觀察解毒方改善sorafenib耐藥作用及可能機制。
　　結果:1.成功構建sorafenib耐藥人肝癌細胞株HepG2-R、Huh7-R，sorafenib培養(yǎng)濃度分別為6.0μM、9.0μM。Sorafenib處理后，計算HepG2-R、HepG2的IC50，48h時分

8、別為18.17μM、9.26μM，72h時分別為12.74μM、6.48μM，Huh7-R、Huh7的IC50，48h時分別為23.36μM、10.13μM，72h時分別為16.88μM、5.84μM，各組間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);流式分別檢測耐藥株和敏感株的結果與MTT結果相一致，48小時耐藥株凋亡率明顯低于敏感株(P＜0.05);進一步檢測凋亡相關蛋白發(fā)現，在相同濃度的sorafenib作用下，敏感細胞中的PARP、

9、caspase-8、caspase-3激活比耐藥株更明顯。
　　2.研究ERS在sorafenib耐藥過程中的作用，通過比較敏感/耐藥細胞ERS相關蛋白發(fā)現，耐藥細胞IRE1和PERK信號通路激活程度更高，部分ERS蛋白表達水平更高，使用ERS抑制劑4-PBA可以使耐藥株對sorafenib的敏感性增加，降低PERK、Bip的表達水平，上調Chop水平，凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP活

10、化。但是對ERS凋亡相關caspase-12的影響不明顯。進一步研究ERS相關自噬發(fā)現，與敏感株比較，耐藥細胞自噬水平較高，P62表達減少，LC3Ⅱ表達明顯增加，ERS抑制劑4-PBA聯合sorafenib能夠使P62增加，使LC3Ⅰ向Ⅱ轉化減少，電鏡觀察到了相似的結果，耐藥株與sorafenib處理組可以看到較多的自噬體，而4-PBA處理后，自噬體數量則明顯減少;分別給予自噬抑制劑3-Methyladenine(3-MA)和Chlor

11、oquine(CQ)處理耐藥株后，sorafenib對耐藥株的增殖抑制率和凋亡率明顯增加。
　　3.通過比較敏感株和耐藥株中凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-12，我們發(fā)現，caspase-8在經過sorafenib處理的敏感細胞中被顯著激活，而在耐藥株中則不易被激活，因此我們進一步觀察caspase-8抑制蛋白c-FLIP在sorafenib耐藥中的作用。Sorafenib處理后，耐藥細胞中c-FL

12、IP的表達要高于敏感細胞;采用siRNA干擾c-FLIP后，無論是耐藥的Huh7-R細胞還是HepG2-R細胞對sorafenib的敏感性都顯著增加，c-FLIP siRNA組與NC組比較，細胞增殖抑制率和凋亡率增加(P＜0.05);進一步觀察c-FLIP siRNA干擾對ERS相關蛋白和caspase-8的影響，經過sorafenib處理，HepG2-R的PERK、Bip水平降低，Chop水平升高，caspase-8剪切體明顯增多，表

13、明c-FLIP在調節(jié)耐藥細胞的ERS相關通路和抑制caspase-8激活方面發(fā)揮了重要作用。過表達c-FLIP后，可以降低解毒方聯合sorafenib對于耐藥細胞的抑制作用，進一步證實，解毒方通過降低c-FLIP改善sorafenib耐藥。
　　4.解毒方在體外可以改善sorafenib耐藥。將不同濃度的解毒方(JDF0.1mg/ml、JDF0.2mg/ml、JDF0.4mg/ml)、sorafenib(Sora2.5μM、Sor

14、a5μM、Sora7.5μM)以及解毒方(JDF0.2mg/ml、JDF0.4mg/ml、JDF0.5 mg/ml)、sorafenib(Sora5μM、Sora10μM、Sora15μM)分別作用于耐藥HepG2-R和Huh7-R細胞48h，未發(fā)現明顯的增殖抑制作用，存活率均大于80％(P＞0.05)。而將不同濃度的JDF與sorafenib聯合應用，則可以顯著增加sorafenib耐藥株的抑制率，差異具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，

15、且成一定的濃度依賴性，通過計算聯合作用指數(combined index，CI)，CIHepG2-R=0.58(JDF0.4mg/ml+Sora5μM)，CIHuh7-R=0.33(JDF0.5mg/ml+Sora5μM)，表明JDF和sorafenib具有一定協(xié)同作用。Western blot檢測發(fā)現，JDF和sorafenib聯合作用后，c-FLIP表達降低，且呈濃度依賴性，PERK通路激活，Chop水平上調。
　　5.體內結

16、果提示，JDF聯合sorafenib可以顯著抑制耐藥細胞皮下瘤生長。構建Huh7、Huh7-R皮下移植瘤裸鼠模型，兩組裸鼠給予低劑量sorafenib干預約4周后，僅Huh7-R組裸鼠出現皮下移植瘤，Huh7組未見明顯皮下瘤，表明體內耐藥模型構建成功，分別給予Vehicle、Sorafenib、JDF+Sorafenib、JDF干預15天后，Sorafenib與JDF組的瘤重與Vehicle組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而J

17、DF+Sorafenib組瘤重低于Vehicle組瘤重，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，通過Western Blot檢測腫瘤組織中的蛋白表達發(fā)現，JDF聯合sorafenib能夠激活IRE1和PERK通路，上調促凋亡chop蛋白水平，同時抑制c-FLIP表達，激活caspase-8，與體外結果一致。此外，各組裸鼠肝腎組織病理結果提示，本實驗中JDF與sorafenib聯合應用無體內毒性。
　　結論:1.索拉非尼耐藥與c-FL