CXCL12-CXCR4介導少突膠質(zhì)前體細胞髓鞘化的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　軸突脫髓鞘改變是脊髓損傷的重要病理變化，前期研究表明，移植少突膠質(zhì)前體細胞(Oligodendrocyte precursor cells，OPCs)能夠促進損傷軸突再髓鞘化。但是再生髓鞘的形態(tài)和厚度跟生理狀態(tài)下髓鞘的產(chǎn)生存在差別，并且再髓鞘化的確切機制也不清楚。少突膠質(zhì)細胞(Oligodendrocyte，OL)中的PI3K/AKT和ERK通路激活后可以增強髓鞘形成相關蛋白的表達，其中髓鞘堿性蛋白(myelin ba

2、sic protein，MBP)和蛋白脂質(zhì)蛋白(proteolipid protein，PLP)是髓鞘形成的主要蛋白。脊髓損傷后細胞間質(zhì)內(nèi)CXCL12升高，并與CXCR4特異性結(jié)合，跟OPCs的遷移和分化關系密切;而PI3K/AKT和ERK通路是CXCL12/CXCR4分子信號常見的下游通路。因此我們推測：在OPCs參與再髓鞘化的過程中，CXCL12是激活PI3K/AKT和ERK通路的關鍵因子，通過PI3K/AKT和ERK通路介導OPC

3、s中MBP與PLP的高表達，對再生髓鞘形態(tài)及厚薄發(fā)揮重要的調(diào)控作用。擬采用免疫細胞化學技術、增強及阻斷干預、體外實驗等手段，闡明CXCL12/CXCR4在介導OPCs參與軸突再髓鞘化的作用機制。
　　方法：
　　1.用改良后的振蕩分離和差速貼壁方法原代培養(yǎng)新生SD大鼠大腦皮質(zhì)層OPCs，根據(jù)OPCs和OL細胞表面的特異性抗原表達的不同，利用免疫熒光實驗技術進行分離鑒定;
　　2.體外條件下檢測濃度效應相關性，用West

4、ern blot方法檢測不同濃度的CXCL12(0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL)對髓鞘形成相關蛋白MBP和PLP蛋白表達的影響，并用免疫熒光方法檢測MBP和PLP的表達變化;
　　3.體外條件下檢測時間效應相關性，用Western blot方法檢測CXCL12(20ng/mL)在不同時間點(12h、24h、48h、72h)對髓鞘形成相關蛋白MBP和PLP表達的影響，并用免疫熒光方法檢測MBP和PLP的表

5、達變化;
　　4.通過前期本實驗室篩選出的CXCR4基因有效干擾靶點信息，用CXCR4siRNA干擾OPCs細胞膜上CXCR4蛋白表達，用Western blot方法檢測CXCL12(20ng/mL)對少突膠質(zhì)前體細胞CXCR4、MBP和PLP表達的影響，并用免疫熒光方法檢測MBP和PLP的表達變化;
　　5.用LY294002抑制PI3K/AKT通路活性，用U0126抑制ERK通路活性，用Westernblot方法檢測在C

6、XCL12(20ng/mL)條件下，PI3K/AKT和ERK通路對髓鞘形成相關蛋白MBP和PLP表達中的影響，并用免疫熒光方法檢測MBP和PLP的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1.通過改良后的震蕩分離和差速貼壁的方法進行OPCs原代培養(yǎng)，可以獲得大量純度高的OPCs。胞體近似圓形，周圍可見對稱雙極或三極細胞突起，胞體小，直徑約10μm，折光性好，PDGFR-α表達呈陽性;誘導中期OPCs胞體呈圓形，胞體周圍纖細突起增多，O4表

7、達呈陽性;誘導晚期胞體周圍出現(xiàn)大量網(wǎng)狀纖細突起，呈“分枝”狀分布，MBP表達呈陽性。
　　2.CXCL12的濃度跟MBP和PLP的表達呈濃度效應相關性。在一定濃度范圍內(nèi)，增加細胞外CXCL12的濃度，MBP和PLP的表達量逐漸增加。與0ng/mL相比，CXCL12濃度為20ng/ml時，MBP表達量明顯增加(p＜0.01)，PLP的表達量也明顯增加(p＜0.01)。免疫熒光實驗結(jié)果顯示：OPCs在不同濃度的CXCL12作用下處理4

8、8h后，在CXCL12濃度為20ng/mL時，MBP和PLP表達增加明顯。
　　3.CXCL12的作用時間跟MBP和PLP的表達呈時間效應相關性。在一定時間范圍內(nèi)，細胞外CXCL12濃度為20ng/mL并增加作用的時間，MBP和PLP的表達量逐漸增加。與0h相比，作用時間為72h時，MBP表達量明顯增加(p＜0.01)，PLP的表達量也明顯增加(p＜0.01)。免疫熒光實驗結(jié)果顯示：CXCL12濃度為20ng/m并作用時間為72h

9、時，MBP和PLP均能觀察到明顯的表達。
　　4.CXCR4siRNA干擾CXCR4蛋白表達后，與對照組相比，OPCs髓鞘形成相關蛋白MBP和PLP的表達量明顯受到抑制(P＜0.01)。免疫熒光實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，CXCR4siRNA干擾組的MBP和PLP蛋白表達量明顯降低。
　　5.與CXCL12組相比，CXCL12+LY294002組的p-AKT蛋白表達量明顯降低(t=-19.630，P＜0.01)，CXCL12

10、+U0126組的p-ERK蛋白表達量也明顯降低(t=-6.005，P＜0.05)，并且CXCL12+LY294002和CXCL12+U0126組的MBP和PLP蛋白相對表達量明顯降低(P＜0.05)。免疫熒光實驗結(jié)果顯示：與CXCL12組相比，CXCL12+LY294002組和CXCL12+U0126組MBP和PLP蛋白相對表達量明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗體外培養(yǎng)OPCs，通過改良后的震蕩分離和差速貼壁的方法進行