突變體p53通過抑制miR-26a上調(diào)EZH2促進子宮內(nèi)膜癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機制研究.pdf

1、目的：探討突變體p53促進子宮內(nèi)膜癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的分子機制。
　　內(nèi)容：檢測突變體p53和EZH2在子宮內(nèi)膜癌組織中表達并分析二者相互關(guān)系和EZH2與臨床病理參數(shù)之間關(guān)系，探討突變體p53與EZH2之間互相調(diào)控關(guān)系及分子機制，評估 miR-26a對 TP53突變細胞生物學行為影響，檢測患者血清中miR-26a表達并分析與患者預(yù)后關(guān)系。
　　方法：用免疫組化、Western blot、細胞免疫熒光檢測蛋白表達，用q

2、RT-PCR檢測miRNA和miRNA表達，用siRNA和shRNA沉默基因表達，用過表達質(zhì)粒和慢病毒上調(diào)基因表達，用ChIP-PCR和 RNA-ChIP檢測蛋白質(zhì)與核酸相互作用，用CO-IP檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，用熒光素酶報告質(zhì)粒驗證miRNA下游靶基因，用Transwell實驗分析細胞遷移及侵襲能力改變。
　　結(jié)果：與I型子宮內(nèi)膜癌相比，EZH2與p53均高表達于II型子宮內(nèi)膜癌中，且二者間存在顯著正相關(guān)，EZH2高表達

3、提示臨床分期晚、深肌層浸潤、病理分級高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。沉默突變型p53發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白表達出現(xiàn)顯著降低，但其mRNA表達水平無明顯改變。突變型p53通過抑制miR-26a表達在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控EZH2蛋白表達。機制為p53突變一方面失去與miR-26a-1啟動子區(qū)域結(jié)合而失去對其轉(zhuǎn)錄激活作用，另一方面通過干擾 Drosha-p68復合體組裝，削弱對pri-miR-26a-1剪切，二者共同降低 miR-26a成熟體表達量。EZH2是 miR-

4、26a下游直接調(diào)控靶標。外源性miR-26a轉(zhuǎn)入顯著抑制p53突變HEC-1B細胞的遷移和侵襲能力,同時逆轉(zhuǎn)其EMT轉(zhuǎn)化。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)miR-26a能有效降低TP53突變的HEC-1B細胞成瘤能力。體內(nèi)外實驗共同證實了 miR-26a能有效上調(diào)E-cadherin表達，而抑制 N-cadherin、Vimentin、Snail表達。此外體內(nèi)實驗也證實了miR-26a負性調(diào)控EZH2蛋白表達。miR-26a在II型內(nèi)膜癌患者血清中顯著低表

5、達，且與預(yù)后不良相關(guān)。
　　結(jié)論：TP53突變通過突變體p53/miR-26a/EZH2調(diào)控軸促進子宮內(nèi)膜癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而增加子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲能力，miR-26a不僅可能成為治療p53突變“高危型”內(nèi)膜癌靶標還可能成為判斷子宮內(nèi)膜癌預(yù)后標志物。
　　第一部分： EZH2與突變體p53在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及意義
　　目的：分析EZH2在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及與p53表達相

6、關(guān)性。
　　方法：應(yīng)用免疫組織化學方法半定量檢測子宮內(nèi)膜腺癌組織中EZH2和p53蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　(1)與I型子宮內(nèi)膜癌相比，EZH2與p53在II型子宮內(nèi)膜癌組織中均高表達（P＜0.001）。
　　(2) EZH2與p53表達呈顯著正相關(guān)（Spearman correlation r=0.739）。
　　(3) EZH2高表達提示臨床分期晚（P＜0.001）、深肌層浸潤（P＜0.023）、病理

7、分級高（P＜0.001）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.002）。
　　結(jié)論：EZH2與p53均在II型子宮內(nèi)膜癌組織中高表達，且二者間存在顯著正相關(guān)；EZH2高表達與子宮內(nèi)膜癌進展相關(guān)。
　　第二部分：突變體p53通過下調(diào)miR-26a促進EZH2表達
　　目的：選用TP53野生型與突變型不同子宮內(nèi)膜癌細胞株，探索突變體p53與EZH2表達相關(guān)性及調(diào)控關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用蛋白印記（Western blot）方法檢測子宮

8、內(nèi)膜癌細胞株中EZH2與p53蛋白的表達；分別使用EZH2 siRNA、TP53 siRNA及陰性對照分別瞬時轉(zhuǎn)染HEC-1B和KLE細胞，分別應(yīng)用qRT-PCR方法和Western blot方法檢測EZH2和p53 mRNA和蛋白的表達；應(yīng)用在線生物信息學軟件（TargetScan）預(yù)測可能調(diào)控EZH2表達的miRNA，應(yīng)用qRT-PCR篩選突變體p53可能抑制的miRNA；分別使用miR-26a mimics、miR-26a inh

9、ibitors（anti-miR-26a）及陰性對照瞬時轉(zhuǎn)染HEC-1B和Ishikawa細胞，分別檢測轉(zhuǎn)染前后EZH2 mRNA和蛋白表達變化。
　　結(jié)果：
　　(1)與SPEC-2和 Ishikawa細胞相比，EZH2在AN3CA和TP53突變的HEC-1B和KLE細胞中高表達(P＜0.001)。
　　(2)沉默EZH2后突變體p53 mRNA及蛋白均無明顯改變（P＞0.05）。
　　(3)沉默突變體p53后

10、EZH2蛋白出現(xiàn)明顯降低（P＜0.05）但其mRNA無改變（P＞0.05）。
　　(4)沉默突變體p53顯著增加HEC-1B和KLE細胞中miR-26a表達(P＜0.05)。
　　(5) miR-26a mimics轉(zhuǎn)入HEC-1B細胞抑制EZH2蛋白表達，anti-miR-26a轉(zhuǎn)入 Ishikawa細胞增加EZH2蛋白表達，均不影響mRNA水平改變。
　　結(jié)論：突變體p53可能通過抑制miR-26a促進EZH2蛋白

11、表達
　　第三部分：突變體p53通過下調(diào)miR-26a促進EZH2表達分子機制
　　目的：探索突變體p53下調(diào)miR-26a分子機制以及EZH2是miR-26a直接調(diào)控靶標驗證。
　　方法：分別使用TP53 siRNA及陰性對照分別瞬時轉(zhuǎn)染HEC-1B細胞，應(yīng)用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后pre-miR-26a-1、pre-miR-26a-2表達變化；應(yīng)用ChIP-PCR方法檢測突變體p53、野生型p53與miR-26a

12、-1啟動子區(qū)域結(jié)合能力；應(yīng)用免疫共沉淀（CO-IP）方法檢測突變體p53與p68相互作用、p68與Drosha蛋白相互作用；分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p68 shRNA與p68過表達質(zhì)粒至HEC-1B細胞和無TP53的HEC-50細胞，應(yīng)用qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后miR-26a表達變化；分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同突變體p53與野生型p53表達質(zhì)粒至無TP53的HEC-50細胞，應(yīng)用Western blot方法和qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后EZH2蛋白及

13、miR-26a表達變化；應(yīng)用RNA-ChIP方法檢測p68、Drosha蛋白與pri-miR-26a-1相互作用，構(gòu)建熒光素酶報告質(zhì)粒和應(yīng)用雙熒光素酶檢測檢測系統(tǒng)驗證EZH2是miR-26a調(diào)控靶標。
　　結(jié)果：
　　(1)沉默突變體p53后pre-miR-26a-1和pre-miR-26a-2表達均升高約2倍（P＜0.005），但pre-miR-26a-1基線表達量是pre-miR-26a表達量近150倍（P＜0.0001

14、）。
　　(2)野生型p53與miR-26a-1啟動子區(qū)域能力顯著顯著大于突變體p53。
　　(3)突變體p53與p68相互結(jié)合，沉默p68顯著降低miR-26a表達（P＜0.001），外源性p68再表達逆轉(zhuǎn)miR-26a表達。
　　(4)野生型p53轉(zhuǎn)入HEC-50細胞增加miR-26a表達而顯著抑制EZH2蛋白表達，突變體p53轉(zhuǎn)入HEC-50細胞抑制miR-26a表達而顯著增加EZH2蛋白表達。
　　(5)

15、野生型 p53轉(zhuǎn)入 HEC-50細胞不影響 pri-miR-26a-1表達，但顯著增加pre-miR-26a-1表達；突變體 p53轉(zhuǎn)入 HEC-50細胞不影響 pri-miR-26a-1表達，但不同程度顯著抑制pre-miR-26a-1表達。
　　(6)野生型p53轉(zhuǎn)入HEC-50細胞增加p68與Drosha蛋白相互作用，而突變型p53轉(zhuǎn)入HEC-50細胞顯著抑制p68與Drosha蛋白相互作用
　　(7)野生型p53轉(zhuǎn)入

16、HEC-50細胞增加p68、Drosha蛋白與pri-miR-26a-1相互作用，而突變型 p53轉(zhuǎn)入 HEC-50細胞顯著抑制 p68、Drosha蛋白與pri-miR-26a-1相互作用。
　　(8)野生型EZH23’非翻譯區(qū)（EZH23’UTR）組，miR-26a轉(zhuǎn)入降低熒光強度超過65%(P＜0.001)，然而突變型EZH23’UTR組，miR-26a轉(zhuǎn)入熒光強度僅出現(xiàn)輕度減低(P=0.0122)。
　　結(jié)論：p53

17、突變一方面通過失去與miR-26a-1啟動子區(qū)域結(jié)合，失去其轉(zhuǎn)錄激活作用，另一方面通過干擾Drosha-p68復合體組裝削弱pri-miR-26a-1處理，共同減少miR-26a表達量，EZH2是miR-26a下游直接調(diào)控靶標，miR-26a表達減少失去對EZH2表達抑制，故EZH2在突變型子宮內(nèi)膜癌中高表達。
　　第四部分：miR-26a對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學行為影響
　　目的：探索miR-26a對子宮內(nèi)膜癌細胞遷移、侵襲

18、及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。
　　方法：分別使用miR-26a mimics及陰性對照瞬時轉(zhuǎn)染 EZH2高表達 HEC-1B和AN3CA細胞，分別使用anti-miR-26a及陰性對照瞬時轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞，應(yīng)用transwell遷移、侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染前后子宮內(nèi)膜癌細胞遷移、侵襲能力改變，應(yīng)用Western blot方法和免疫熒光方法檢測轉(zhuǎn)染前后上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）指標E-cadherin、N-cadherin

19、、Vimentin和Snail蛋白表達變化。
　　(1)再表達miR-26a顯著抑制TP53突變的HEC-1B細胞遷移及侵襲能力，亦抑制EZH2高表達AN3CA細胞侵襲能力。
　　(2)抑制miR-26a表達增加EZH2低表達Ishikawa細胞侵襲能力。
　　(3) miR-26a上調(diào)TP53突變的HEC-1B細胞中上皮細胞標志物E-cadherin表達，抑制間質(zhì)細胞標志物N-cadherin、Vimentin及Sn

20、ail蛋白表達。
　　結(jié)論：miR-26a通過抑制EZH2促進子宮內(nèi)膜癌細胞間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）。
　　第五部分：miR-26a調(diào)控EZH2表達發(fā)揮抑癌作用體內(nèi)驗證
　　目的：探索miR-26a對TP53突變的子宮內(nèi)膜癌細胞體內(nèi)成瘤能力的影響并進一步體內(nèi)實驗驗證miR-26a對理論靶基因EZH2的表達調(diào)控。
　　方法：構(gòu)建包裝miR-26a表達慢病毒（LV-miR-26a）及陰性對照，分別轉(zhuǎn)染TP53突變的

21、HEC-1B細胞后注射于成熟雌性裸鼠頸部皮下進行成瘤實驗，分別繪制瘤體生長曲線，進行瘤體稱重，應(yīng)用免疫組織化學方法檢測移植瘤中E-cadherin、Vimentin、EZH2和Ki67蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　(1)轉(zhuǎn)染miR-26a表達慢病毒組腫瘤的體積和瘤體重量明顯小于對照組。
　　(2)轉(zhuǎn)染miR-26a表達慢病毒組瘤體組織中上皮標志物E-cadherin高表達、間充質(zhì)標標記物Vimentin低表達、增殖指標K

22、i67低表達。
　　(3)轉(zhuǎn)染miR-26a表達慢病毒組瘤體組織中miR-26a下游調(diào)控靶標EZH2低表達。
　　結(jié)論：體內(nèi)miR-26a負性調(diào)控下游靶標EZH2蛋白的表達并發(fā)揮抑癌基因作用。
　　第六部分：血清miR-26a表達與臨床預(yù)后關(guān)系
　　目的：檢測子宮內(nèi)膜癌患者血清中miR-26a表達并分析其與臨床預(yù)后關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜癌患者血清中miR-26a表達。
　　結(jié)