雌激素作用下FGFR1對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化及RSK2表達(dá)影響的研究.pdf

1、背景:骨質(zhì)疏松癥是臨床常見的一種骨骼退行性疾病，它的發(fā)生是因?yàn)楣侵亟ǖ膭?dòng)態(tài)平衡被打破。雌激素能夠通過(guò)復(fù)雜的分子機(jī)制影響成骨細(xì)胞的功能，促進(jìn)骨改建。FGF/FGFR信號(hào)為成骨過(guò)程當(dāng)中的重要調(diào)節(jié)因子，對(duì)骨骼的發(fā)育、形成和修復(fù)過(guò)程具有重要的生理意義，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Ⅰ型受體(FGFR1)是出生后成骨細(xì)胞表達(dá)的主要FGFRs。P90核糖體S6蛋白激酶(RSK2)是位于Raf-MEK-ERK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路下游的一類具有重要作用的效應(yīng)分子，可以通過(guò)

2、多種細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化過(guò)程調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化和存活等。前期實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用17-β雌二醇（濃度為10-8mol/L）作用于MC3T3-E1細(xì)胞株，培養(yǎng)5天后，通過(guò)全基因組基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)FGFR1和RSK2的基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示FGFR1和RSK2在成骨細(xì)胞對(duì)雌激素的反應(yīng)信號(hào)調(diào)控中可能起重要作用。因此，進(jìn)一步研究雌激素作用下FGFR1與RSK2間的相互聯(lián)系及通訊對(duì)成骨細(xì)胞的影響和作用機(jī)制，可以揭示骨形成和改建的發(fā)生機(jī)理，同時(shí)也為牙槽骨

3、的改建塑形，骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)骨疾病的治療提供重要靶點(diǎn)。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)擬采用特異性FGFR1受體抑制劑PD166866，對(duì)體外培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞株施加雌激素，結(jié)合MTT、ALP、Westernblot和RT-PCR檢測(cè)，以研究雌激素作用下FGFR1對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的作用，通過(guò)檢測(cè)通路中RSK2因子的表達(dá)，確定雌激素是否通過(guò)FGFR1作用于RSK2影響成骨細(xì)胞的增殖分化，從而針對(duì)這個(gè)機(jī)制和過(guò)程制定有效的應(yīng)對(duì)策略，為相關(guān)骨

4、疾病的治療提供新思路。
　　方法:1.小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞系體外培養(yǎng)。
　　2.實(shí)驗(yàn)分為四組，即空白對(duì)照組，F(xiàn)GFR1抑制劑（5×10-8mol/L的PD166866）組，雌激素（10-8mol/L的17-β雌二醇）組，雌激素（10-8mol/L的17-β雌二醇）+FGFR1抑制劑（5×10-8mol/L的PD166866）組。
　　3.應(yīng)用MTT技術(shù)和ALP技術(shù)分別檢測(cè)四組細(xì)胞的增殖能力和分化活性。

5、>　　4.應(yīng)用免疫印跡技術(shù)(Western blot)分別檢測(cè)四組細(xì)胞的RSK2及其磷酸化水平和OCN的表達(dá)水平。
　　5.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)Runx2 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　6.采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:1.MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。
　　2.細(xì)胞增殖情況(MTT):與空白對(duì)照組相比，雌激素組細(xì)胞增殖活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);加入FGFR1抑制

6、劑后，細(xì)胞增殖活性降低（P＜0.05）。
　　3.細(xì)胞分化情況（堿性磷酸酶ALP）:與空白對(duì)照組相比，雌激素可增加細(xì)胞堿性磷酸酶的表達(dá)（P＜0.05）;加入FGFR1抑制劑后，雌激素組和非雌激素組的堿性磷酸酶活性均增加（P＜0.05）。
　　4.Westernblot免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RSK2、p-RSK2及OCN蛋白表達(dá)水平:結(jié)果顯示四個(gè)組的RSK2表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異(P＞0.05);17-β雌二醇作用下RSK2的磷酸化

7、水平及OCN的表達(dá)明顯增加(P＜0.05);FGFR1抑制劑組的RSK2的磷酸化水平及OCN的表達(dá)也增加(P＜0.05);17-β雌二醇+FGFR1抑制劑聯(lián)合刺激組與僅加入FGFR1抑制劑或雌激素組相比，RSK2的磷酸化水平及OCN蛋白表達(dá)量上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.成骨分化相關(guān)基因Runx2的mRNA表達(dá)水平:結(jié)果顯示，17-β雌二醇作用下，Runx2的mRNA表達(dá)上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;加入FG

8、FR1抑制劑后，Runx2 mRNA表達(dá)水平也升高（P＜0.05）;17-β雌二醇+FGFR1抑制劑聯(lián)合刺激組與僅加入FGFR1抑制劑或雌激素組相比，Runx2mRNA表達(dá)增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:1.FGFR1參與了雌激素作用下成骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)。FGFR1信號(hào)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，抑制分化。
　　2.抑制FGFR1可引起RSK2磷酸化水平增高，雌激素通過(guò)FGFR1與RSK2調(diào)控成骨作用的機(jī)制還有待